脆性X综合症(Fragile X Syndrome)是最常见的遗传性智力障碍之一,发病率在男性为1/4000,女性为1/8000。其症状表现为不同严重程度的智力障碍、自闭行为、成年男性巨睾症、特殊面容(如长脸,长耳)、关节高柔韧等。脆性X综合症主要由脆性X智力障碍基因1(FMR1)的5’端非翻译区大量CGG三核酸重复序列的扩增导致(通常大于200个CGG)。继而,重复序列本身和/或附近CPG岛的DNA发生异常甲基化,致使FMR1基因的转录沉默。该综合症是由FMR1基因的蛋白产物-—脆性X智力障碍蛋白的缺失而导致。已发现的该基因的其他突变(通过如缺失该基因的病人所表现出典型的遗传表型)进一步证实了FMR1是涉及脆性X综合症病理机制的唯一基因。在哺乳动物中,FMRP与其脆性X相关蛋白FXR1P和FXR2P组成一个非常保守的RNA结合蛋白小家族(脆性X相关基因家族)。它们的氨基酸有60%的相同性,并都含有两种类型的RNA结合序列,两个核糖核蛋白KH区和一个RGG盒。与哺乳动物不同,果蝇基因组只有一个单一的FMR1基因。序列比较显示,果蝇的基因功能区与哺乳动物的FMR1具有高度的相似性:56%相似度和35%相同度。为理解脆性X综合症的分子病理机制,研究者已制备了小鼠和果蝇的疾病动物模型,并进行了深入研究。在这些动物模型中,除了学习、记忆上的缺陷外,另一个非常一致的行为异常就是昼夜节律行为的改变。缺失FMR1基因的果蝇依靠亮/暗周期来维持昼夜节律,而野生型果蝇可在持续黑暗中维持昼夜节律。这一昼夜节律行为的改变与脆性X综合征患者的睡眠障碍非常相似。睡眠障碍包括睡眠时程短、睡眠时程变化大、经常的夜间觉醒和睡眠调定问题等在脆性X患者中非常普遍,这些睡眠问题被认为与昼夜节律失调有关。昼夜节律(Circadian Rhythms)一词来源于希腊文,circa:大约,Diem:天,即大约24小时的周期。哺乳动物的中枢位于前下丘脑的视交叉上核(SCN),果蝇的位于腹外侧(LNvs)。生物节律包括:活动、觅食行为,睡眠/觉醒模式及一系列生理、代谢通路。这些昼夜输出由中心启动者调节,中心启动者又接受环境输入如光照等以保持昼夜时间。昼夜节律发生器是一个转录的环路。微RNA(microRNA)是一类高度保守的非编码RNA,它们可调节转录后的基因表达。最近的几项研究显示,生物钟过程可被某些microRNA所调节。尽管在小鼠和果蝇的脆性X综合症动物模型中都观察到昼夜节律的改变,其潜在的分子机制仍然不清楚。果蝇是人类神经系统疾病生化通路基因解剖的有力工具,在此,我们以果蝇为模型进行了包括信使RNA和microRNA等在内的一系列基因表达分析,对不同时间点的信使RNA和microRNA的表达特征及microRNA对信使RNA的调节进行了研究,为进一步理解FMRP和microRNA因素在果蝇昼夜节律输出过程的作用提供了信息。研究目的:鉴于脆性X综合症患者中广泛存在的睡眠障碍及既往研究在FXS基因突变小鼠、果蝇动物模型中观察到的昼夜节律行为改变,本研究通过基因芯片、荧光定量PCR、免疫沉淀等基因表达分析方法,以果蝇为模型探求其昼夜行为节律改变的分子机制。研究方法:1、果蝇品系、处理及RNA样本的准备。本研究选用Fmr1敲除果蝇、dFMR—Del-3-21/TM6C、KrGFP和野生型WT1118。在标准的25℃培养条件下饲养,果蝇孵出后先予清空饲养瓶,收集2日内新孵出的雄性果蝇,分置于7个培养管中,将十四个培养管放到12小时亮/12小时暗(LD)的培养箱饲养4天,在第5天为持续黑暗(DD),在第5天早晨8点开始,每四小时取出Fmr1敲除和野生型果蝇各一管,分离果蝇的头部,合并后放入Trizol中研磨,提取RNA。2、中心启动节律的检测将提取的部分RNA反转录后,用荧光定量PCR方法检测七个不同时间点Period、Timeless基因的表达。3、mRNA表达的基因芯片分析。选取2个批次的CT00、CT12两个时间点的两组RNA标本进行基因芯片分析,依照基因芯片使用者手册准备标本、扫描芯片、用GeneSifter软件分析。4、微RNA(microRNA)的表达特征将Fmr1敲除果蝇和野生型两组CT00、CT12两个时间点的部分RNA用已知的72种TaqMan microRNA检测试剂盒,全面进行microRNA表达谱分析。5、微RNA靶标基因分析应用target scan和miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)进行分析6、果蝇头标本FMRP与微RNA相关分析约300个果蝇头标本用FMRP-Ab进行免疫共沉淀,对洗脱液和沉淀珠子分别进行Western分析,及提取RNA后进行微RNA表达谱分析。7、筛选出的微RNA的前体和原前体表达分析设计微RNA前体和原前体引物,用荧光定量PCR检测相应时间点微RNA前体、原前体表达。结果:1、Period、Timeless呈24小时周期样振荡。果蝇脑中核心节律启动器的节律未发生改变。2、部分基因随昼夜节律的改变而表现出表达改变。3、数种微RNA MiR-1、MiR-281亦随昼夜节律的改变表现出表达改变,并且微RNA:MiR-1、MiR-281在随昼夜节律改变而表现出表达改变的mRNA上有作用靶点。4、MiR-1和MiR-281的前体和原前体表达未发现如MiR-1和MiR-281出现的较大表达差异。结论:1、FMRP的缺失未改变果蝇脑中核心节律启动器的节律,FMRP和微RNA因素参与果蝇昼夜节律输出过程进行调控,在基因敲除果蝇中有数种信使RNA,及微RNA中的MiR-1和MiR-281呈现出与野生型果蝇不同的昼夜节律依赖性改变,MiR-1和MiR-281可能通过基因表达转录产物上的靶点对转录基因组,基因表达进行负向调控,进而影响物质代谢、运动通路,从而导致果蝇昼夜节律行为的改变。2、FMRP与MiR-1、MiR-281相关。FMRP可能通过对MiR-1和MiR-281的前体和原前体的生物处理过程的影响,调控MiR-1和MiR-281的生物生成,进而通过基因表达转录产物上的靶点对转录基因组,基因表达产物进行负向调控,进而影响昼夜节律输出通路。