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目的:研究NGC、B株DEN-2NS1基因部分序列在HUVEC中表达后对其一氧化氮(Nirticoxide,NO)分泌及Toll样受体3(Tolllikereceptor3,TLR3)、磷酸化干扰素调节因子3(Phosphorylationinterferonregulatorfactor3,pIRF3)、干扰素调节因子3(interferonregulatorfactor3,IRF3)信号通路的影响。 方法:用脂质体LipofectamineRNAi-MAX将本课题组构建的NGC株、B株重组质粒(pcDNA3.1(+)-N-NS1、pcDNA3.1(+)-B-NS1)转染至HUVEC,瞬时表达24h、72h,激光共聚焦扫描显微镜观察NGC、B株NS1基因部分序列在HUVEC中的表达;G418(700μg/ml)筛选形成克隆细胞,建立稳定转染细胞模型(HUVEC/N-NS1s、HUVEC/B-NS1s),RT-PCR及Western-blot鉴定NGC、B株NS1基因在稳定转染细胞中的表达。实验为三组:未转染HUVEC组、HUVEC/N-NS1s及HUVEC/B-NS1s组,培养各组细胞16h、26h、37h,收集上清,用亚硝酸盐/硝酸盐比色反应法检测NO浓度变化情况;用IFN-α(1800μg/ml)预处理,再用poly(I:C)(90μg/ml)刺激各组细胞,作用时间分别为12h+4h、24h+2h、36h+1h,Western-blot检测TLR3、pIRF3及胞核内IRF3蛋白表达情况。 结果: 1.瞬时转染72h,激光共聚焦扫描显微镜检测,B株NS1基因瞬时表达的部分细胞胞浆中可见红色荧光,确定为瞬时表达NS1蛋白。 2.稳定转染45d,RT-PCR及Westernblot检测,确定转染成功,获得表达NS1基因部分序列细胞株。 3.亚硝酸盐/硝酸盐比色反应法检测,随时间延长,各组细胞分泌NO浓度逐渐升高,且HUVEC/B-NS1s组较其它组高,差异有统计学意义(P<0.05)。 4.用IFN-α预处理各组细胞24h,再用poly(I:C)刺激2h,Westernblot检测,与HUVEC比较,HUVEC/N-NS1s及HUVEC/B-NS1s组胞核内IRF3蛋白表达降低,且HUVEC/B-NS1s组低于HUVEC/N-NS1s组,差异有统计学意义(P<0.05);此外,HUVEC/N-NS1s组TLR3、pIRF3蛋白表达均高于其它组,差异有统计学意义(P<0.05),而HUVEC/B-NS1s组TLR3、pIRF3蛋白表达低于其它组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论: 1.成功建立NGC、B株NS1基因部分序列稳定表达细胞株。 2.用IFN-α(1800μg/ml)预处理HUVEC24h,再用poly(I:C)(90μg/ml)刺激2h,可增强胞核内IRF3蛋白的表达。 3.NGC、B株NS1基因部分序列在HUVEC中表达后可能通过TLR3相关信号转导对下游分子IRF3蛋白表达有一定抑制作用。 4.HUVEC可分泌一定量NO,且B株NS1基因部分序列在HUVEC中表达后对其分泌有一定影响。