鸡骨是肉鸡加工的主要副产物,目前大量鸡骨没有得到充分的开发和利用,而是当作废弃物抛弃,造成极大的浪费,且污染环境。Ⅱ型胶原是鸡胸软骨中的主要成分,Ⅱ型胶原独特的结构和功能使其广泛应用于食品、医药及化工等领域。从鸡胸软骨中提取Ⅱ型胶原,不但充分利用了鸡骨资源,减少环境污染,解决了家禽加工资源综合利用的问题,同时也可以得到一种具有高附加值的生物活性物质,具有很大的理论意义和实用价值。本课题采用酶法从鸡胸软骨中制备Ⅱ型胶原,并对其生物活性和结构进行了研究,主要研究内容如下:采用高效液相色谱法建立了Ⅱ型胶原的测定方法。色谱条件为:流动相,A为5%乙腈、0.05%TFA,B为80%乙腈(v/v);采用线形梯度洗脱;检测波长,220 nm;流速,1 mL/min。柱温,35℃,进样量,10μL。高效液相色谱法对Ⅱ型胶原进行定量检测与传统的WoessnerⅠ法具有良好的相关性(R2>0.99)。高效液相色谱法在保证准确性和重现性的基础上,具有省去繁琐耗时的样品预处理、所需样品用量少、易于自动化的优点,从而为Ⅱ型胶原提供了一种新的测定方法。确定了从鸡胸软骨中制备Ⅱ型胶原的工艺路线。首先采用甲醇:氯仿(2:1)低温浸泡除去脂肪,使脂肪的残留率降至0.072%;再用1 mol/L的NaCl溶液浸泡骨料并缓慢搅拌除去大部分盐溶性的杂蛋白;采用胃蛋白酶切除Ⅱ型胶原的端肽,使Ⅱ型胶原由不溶性转为可溶性,胃蛋白酶解温度、时间及胃蛋白酶浓度显著影响Ⅱ型胶原的提取率及二级结构。胃蛋白酶提取鸡胸软骨Ⅱ型胶原的最佳工艺条件为:胃蛋白酶浓度为1%(w/v),酶解温度20℃,酶解时间36h,提取率为43.49%,Ⅱ型胶原保持着比较完整的三股螺旋结构。采用NaCl沉淀酶解液中的Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原最佳的盐析工艺条件为:氯化钠浓度为3 mol/L,盐析温度20℃,盐析时间为24h,回收率为85.93%。采用DEAE-sepharose CL 6B离子交换色谱分离Ⅱ型胶原与糖胺聚糖,由SDS - PAGE及RP-HPLC测定结果表明:鸡胸软骨Ⅱ型胶原样品与Sigma公司标准品及关节软骨Ⅱ型胶原样品的电泳谱带相同,具有较高的α带和少量的β二聚体。图谱上无其他杂带,经纯化后的Ⅱ型胶原的纯度较高。研究了Ⅱ型胶原的结构及理化性质。结果表明Ⅱ型胶原中甘氨酸、羟脯氨酸和丙氨酸含量最高,每1000个氨基酸残基中分别为310、117及115。组氨酸和酪氨酸含量较低,没有检测出色氨酸,为典型动物胶原的氨基酸组成。园二色性及红外测定结果表明Ⅱ型胶原是由三条相同的α链构成的螺旋。Ⅱ型胶原的变性温度为43.843℃,在220 nm附近产生最大的光吸收,在pH值为5.8时,溶解度达到最低。由AFM(原子力显微镜)测定结果表明,Ⅱ型胶原原纤维由一个个成念珠状的结构紧密连接而成,每个念珠即为一个横纹周期(D周期),平均每个周期为65 nm,每个胶原分子的长度约为300 nm,直径约为1.5 nm。Ⅱ型胶原的周期结构对应明带和暗带构成的高低起伏的波状结构,明带对应波峰,暗带对应波谷,每个周期的波峰和波谷有5 nm左右的高度差。以EDC/NHS为交联剂制备Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架,并对Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架修复软骨损伤的功能进行研究。结果表明,EDC/NHS交联增加了胶原支架的热稳定性及对胶原酶的抗性,并降低了游离氨基酸的含量及含水率,从而改善了胶原分子作为细胞支架易降解的缺点。最适的EDC的添加浓度为7 mg/mL。Ⅱ型胶原与硫酸软骨素复合后,细胞亲和性大大提高,软骨细胞能很好的在复合支架上粘附、生长和增殖,并保持软骨细胞特异分化的表型,分泌Ⅱ型胶原与蛋白多糖。培养14天后已有软骨样组织形成,这表明Ⅱ型胶原-硫酸软骨素支架适合作为软骨组织工程研究的细胞载体材料。通过建立大鼠类风湿性关节炎模型,研究了Ⅱ型胶原对人类类风湿性关节炎的防治作用。采用Ⅱ型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎症状主要表现为关节软骨破坏,增生性滑膜炎,并伴有单个核细胞浸润并持续存在于滑膜中。从测得的与RA紧密联系的三种炎性细胞因子水平来看,口服Ⅱ型胶原和氨基葡萄糖显著抑制了RA的发展,提示其治疗作用机理可能与抑制滑膜细胞分泌炎性细胞因子,纠正Th1和Th2细胞平衡失调有关,也进一步表明了Ⅱ型胶原和硫酸氨基葡萄糖作为防治类风湿性关节炎保健品的可行性。