猪链球菌(Streptococcus suis, SS)能引起猪脑膜炎、心内膜炎、败血症、多关节炎、多浆膜炎、肺炎和突然死亡,是造成世界养猪业重大经济损失的主要病原之一。已知的35个血清型中,血清2型的致病力最强、流行范围最广,可感染人。近来,大规模爆发人感染猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)的严重公共卫生事件,出现“毒性休克综合征”的新临床症状,迫使我们必须加强对猪链球菌2型感染的预防和控制。实践证明疫苗预防是消灭和控制传染病的有效手段之一。然而,SS2毒力相关因子和致病机理尚不清楚的现状,严重阻碍了亚单位疫苗的研制,迄今仍无有效预防SS2感染的疫苗可应用。随着微生物基因组学和生物信息学的发展,出现了以全基因组为基础的疫苗发展策略,为疫苗研究带来了新的变革。如Pizza等报道,通过生物信息学工具分析B群脑膜炎奈瑟菌(serogroup B Neisseria meningitidis, MenB)全基因组序列,筛选到570个编码表面暴露蛋白和分泌蛋白的基因,然后逐一克隆、表达候选基因,成功表达了350个候选分子,用于免疫小鼠,其中25个候选分子的特异性抗血清被证实具有很好的杀菌活性。这一工作为发展抗MenB感染的疫苗奠定了基础。目前,这种反向疫苗学研究策略已被用于炭疽杆菌、肺炎衣原体、肺炎链球菌等疫苗的研究,并获得成功。本文从全基因组序列出发,通过生物信息学软件和网站工具预测SS2全基因组序列中编码表面暴露蛋白、分泌蛋白和毒力相关蛋白的基因,然后在原核系统中表达候选基因,纯化目的产物,免疫试验动物,在动物模型评价侯选分子的免疫保护活性,为SS2亚单位疫苗的研究奠定基础。其实验内容和研究结果包括以下几个方面:1、表面暴露蛋白、分泌蛋白和毒力相关因子是有潜力的亚单位疫苗候选分子,本文将其作为生物信息学筛选的疫苗靶标。具体筛选过程为:①利用Cell-PLoc在线服务器分析05ZYH33株中2194个推定蛋白的亚细胞定位,筛选出位于细胞外的蛋白即分泌蛋白,结果获得75个分泌蛋白。②细胞壁锚定蛋白是革兰氏阳性菌主要的表面蛋白,一般含有细胞壁锚定基序,如:细胞壁定位信号基序(LPXTG、IPXTG、NPKTG、NXZTN、LPXAG、FPXTG、LPXTN和LPXTS)和溶素基序。通过BioEdit软件和Sanger institute网站上Search Pfam工具搜寻,从2194个推定蛋白中筛选出76个细胞壁锚定蛋白。③通过BLAST搜索,获得10个与致病性相关的毒力因子(其中3个为SS2已知的毒力因子)和15个与已鉴定的保护性抗原或数据库中的免疫原具有序列相似性的蛋白。综上所述,从05ZYH33株全基因组出发,共筛选到155个不同的疫苗候选基因。为了缩小目标范围,我们广泛收集文献证据,试图从155个基因中挑选出那些曾经有试验证据证实在本菌或其它相关细菌(如肺炎链球菌、B群链球菌等)中可能是保护性抗原的编码基因,这样我们把目光集中到25个分子上。进而,从这25个分子中挑选了最有可能具有保护活性的10个分子(RfeA、IBP、GDH、CWSP、ESA、SIP、SLY、FBP、VaA和SerP)。2、候选基因的克隆、表达和纯化:①以SS2 05ZYH33株基因组DNA为模板,通过PCR扩增到了10个候选基因的全长。②将10基因分别插入原核表达载体pET30b(+),然后转化大肠埃希氏菌Rosetta,除vaA和serP未能表达外,其余8个重组目标蛋白均成功在大肠杆菌中实现表达。③Ni-NTA亲和层析纯化目标融合蛋白,SDS-PAGE电泳分析发现亲和层析纯化后的目标融合蛋白基本无杂蛋白存在。纯化蛋白经透析去盐或透析复性后,冻干备用。3、评价克隆、表达抗原的保护效力:①用纯化的8个蛋白分别免疫BALB/c小鼠,收集抗血清,ELISA检测抗血清效价。结果表明8个分子均能刺激小鼠机体产生免疫应答,其中SIP免疫小鼠产生的抗体效价最低(1∶12800);而RfeA和ESA诱导最强的免疫应答,抗体效价都是1∶819200。IBP和CWSP免疫产生的抗体效价分别为1∶102400和1∶204800,GDH和FBP激发小鼠产生的抗体水平与SLY一致,效价都是1∶25600。②完成最后一次免疫后一周,用致死剂量的SS2高致病性菌株05ZYH33攻击小鼠,观察对照组和免疫组小鼠的存活情况,计算存活率,统计学软件分析各免疫组与对照组存活率差异的显著性,结果表明RfeA组(9/10)、ESA组(7/10)、SLY组(6/10)和IBP组(6/10)小鼠的存活率明显高于对照组(1/10)小鼠(P<0.029),GDH组(2/10)、CWSP组(1/10)、SIP组(3/10)和FBP组(4/10)小鼠的存活率与对照组小鼠差异不显著(P>0.05),从而筛选出RfeA、ESA、SLY和IBP 4个具有明显免疫保护活性的分子。③检测具有免疫保护作用的4种抗原特异性抗血清的IgG亚型,结果表明RfeA、ESA和IBP诱导Th2型免疫反应,SLY诱导Th1-Th2混合型免疫应答。4、保护性抗原的细胞定位分析:将05ZYH33株培养上清包被酶标板,分别检测RfeA、ESA、SLY和IBP特异性抗血清、小鼠免疫前阴性血清,结果表明05ZYH33株上清中存在与RfeA、ESA和SLY抗血清发生特异性反应的抗原成分,即RfeA、ESA和SLY为SS2的分泌性蛋白;IBP特异性抗血清不能与05ZYH33株上清发生阳性反应,表明IBP并非SS2的分泌蛋白。然后用流式细胞仪分析IBP在05ZYH33菌体表面的定位,结果表明IBP特异性抗血清不能与05ZYH33株菌体表面蛋白结合,从检测结果看,IBP也不是SS2的表面蛋白,可能是SS2胞内蛋白。综上所述,本研究利用生物信息学软件和网站工具预测SS2 05ZYH33株全基因组序列中编码表面暴露蛋白、分泌蛋白和毒力相关蛋白的基因,得到155个不同的候选基因。为了缩小目标范围,广泛收集文献证据,挑选出了最有可能具有保护活性的10个分子在原核系统中表达,成功表达了8个重组目的蛋白,用这8个蛋白作为免疫原,在小鼠感染模型中评价它们的免疫保护活性,结果证实RfeA、ESA、IBP和SLY 4种分子都能提供小鼠抵抗猪链球菌2型高致病力菌株致死性攻击的保护力。SLY的免疫保护作用与其他文献报道一致,RfeA、ESA和IBP的免疫保护活性为本文首次报道。新的保护性抗原的获得为SS2亚单位疫苗的研究奠定了基础。