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研究背景和目的随着诊断和以手术为主的综合治疗水平的发展,肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC))患者的生存率已显著提高。但仍有部分患者即使行根治性肝癌切除手术后,仍然出现转移和复发。因此,临床上迫切需要探索HCC复发的相关预测指标来优化治疗方案。传统意义上的预后预测指标为肿瘤的临床病理分期和肿瘤细胞分化分级。该分期和分级能大致反映不同患者术后生存率的差别,但这些指标并不能准确预测转移复发的风险和患者预后。而患者体内的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),即循环肝癌细胞,可能是一个很好的预测指标,因为目前认为肝癌细胞释放入血是肝癌血源性转移的第一步。近年来,随着敏感分子技术的发展,使得分离、计数外周血CTCs成为可能。CTC已经在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤(如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌)中得以应用。最近,我们建立了一种基于去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)的磁性分选和肝细胞特异性抗体Hep Par 1免疫鉴定的循环肝癌细胞分离/鉴定系统,该检测系统具有高度的敏感性和特异性。应用该系统对HCC患者进行检测发现,CTCs阳性率和CTCs数目与肿瘤大小、门静脉癌栓、TNM分期等均具有显著相关性。本研究第一部分中我们针对检测过程中采用肝素抗凝会引起细胞悬液中出现凝胶,影响细胞通过分离柱,降低分离效率的现象,将部分步骤改用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid;EDTA)替代肝素抗凝,明显提高了原检测方法的回收率。第二部分旨在继续探索基于ASGPR的循环肝癌细胞分离/鉴定系统能否预测肝癌患者术后复发的风险,为指导制定个体化治疗方案提供帮助。研究方法1.将原检测法中部分检测步骤改用钙离子螯合剂EDTA替代肝素抗凝。细胞掺入试验评价系统的回收率、敏感性和特异性2.患者入选标准:术前经实验室诊断结合影像学诊断临床确诊为原发性肝癌的患者,第一次行肝癌根治性切除手术,肝功能Child-Pugh分期为A或B级,术后病理学诊断为肝细胞肝癌。3.每位符合入选标准患者于入院后第二天常规检查时、行肝癌切除术后2周各取外周血1次,应用基于ASGPR的循环肝癌细胞分离/鉴定系统行CTCs检测。4.循环肝癌细胞分离检测步骤:采用生物素化去唾液酸胎球蛋白、抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记肝癌细胞,通过磁场分离肝癌细胞。5.定期复查和随访。6. Kaplan-Meier法计算无瘤生存率,Log rank test进行检验。应用Log-rank test行单因素分析,Cox比例风险模型进行多因素分析,比较包括术前及术后CTCs检测结果等预后相关因素与短期复发间的关系。实验结果1.将部分步骤改用EDTA替代肝素抗凝后,在不同细胞掺入水平,改良法的平均回收率较原检测法均显著提高。2. 126例HCC患者外周血样本中,54例术前CTCs检测结果阳性(CTCs检出数≥1),阳性率为42.9%。并且在很早期(I-II,TNM分期)的患者中,仍有17%的患者能够检出CTCs。3.术前CTCs阳性率与患者肿瘤的大小、TNM分期、有无血管侵犯(P=0.001)及有无肝内转移情况有显著相关性,而与年龄、性别、病因、Child-Pugh分级、血清AFP浓度、肿瘤分化程度以及是否合并肝硬化等情况无显著相关性。4. 41例患者术后2周CTCs检测结果阳性,阳性率为32.5%。54例术前CTCs检测结果阳性的患者中,仅20例术后检测仍然阳性;71例患者术前、术后CTCs检测结果均为阴性;34例术前CTCs阳性的患者术后2周再次检测时呈阴性结果;同时21例术前CTCs检测阴性的患者术后2周检测结果呈阳性。5. 126例患者中共27例复发,复发率21.4%,复发时间为:3-16个月,中位复发时间9个月。6.术前CTCs阴性组无瘤生存时间(15.41月,95%CI 11.54-16.29)与术前CTCs阳性组(14.59月,95%CI 13.45-15.73)无显著差别(P=0.133);术前CTCs阴性组复发率(16.7%,12/72)与术前CTCs阳性组复发率(27.8%,15/54)亦无显著差别(P=0.133)。7.术后CTCs阴性组无瘤生存时间(15.79月,95%CI 15.13-16.46)显著长于术后CTCs阳性组的无瘤生存时间(13.56月,95%CI 12.01-15.12)(P=0.007);术后CTCs阳性组的复发率34.1%(14/41)亦显著高于术后CTCs阴性组的复发率15.3%(13/85,P=0.016)。8.将可能影响患者术后复发的因素首先进行单因素分析。分析结果显示,肿瘤大小、肿瘤数目、血管侵犯、肝内转移、肿瘤切缘距离和术后CTCs检测结果等6种因素与术后复发情况显著相关。进一步行多因素逐步Cox模型分析,经筛选后的最佳模型包含3个因素:术后CTCs检测结果(RR=6.62,95%CI:0.86-50.000)、血管侵犯(RR=22.07,95%CI:2.89-169.27)和肿瘤大小(RR=9.80,95%CI:2.17-44.35)。结论本研究结果显示:基于ASGPR的CTCs检测法在HCC患者病程的早期,亦有部分患者外周血中检出CTCs。术前CTCs检测的阳性率与肿瘤大小、TNM分期、血管侵犯和肝内转移等临床病理特征显著相关。HCC患者术后外周血CTCs结果是预测HCC术后复发的独立预测因子之一。应用基于ASGPR的CTCs检测有助于筛查肝癌根治术后高复发风险的HCC患者,从而进行进一步治疗和密切随访。