第一部分 青天葵总黄酮的提取及成份比对目的:提取青天葵中总黄酮成份,并且对该总黄酮提取物进行成份比对。方法:采用“渗漉法”提取青天葵成份,采用AB-8大孔树脂联合聚酰胺方法提取到青天葵总黄酮。采用“高效液相色谱法”及“液相质谱连用法”对该青天葵总黄酮提取物进行成份鉴定。结果:通过对青天葵总黄酮提取物进行成份比对,发现该总黄酮提取物主要含有Complanatuoside(沙苑子苷)与 nervilifordizin A(鼠李秦素-3-O-β-D-木糖-(1→4)-β-D-葡萄糖苷)。结论:青天葵总黄酮的主要成份为Complanatuoside(沙苑子苷)与nervilifordizin A(鼠李秦素-3-0-β-D-木糖-(1→4)-β-D-葡萄糖苷)。第二部分 不同LPS剂量及不同LPS干预时间对BALB/c小鼠ALI模型的影响目的:通过气管内滴注LIPS的造模方式,探讨LPS在三个不同干预时间点对BALB/c小鼠ALI模型状态、体重变化、肺干重湿重变化、肺组织主动转运蛋白和细胞因子、新鲜肺组织外观变化及支气管肺泡灌洗液的影响。方法:将66只BALB/c小鼠随机分为10组,分别是Blank组、6h Sham组、6h 100ug LPS组、6h 200ug LPS 组、24h Sham组、24h 100ugLLPS 组、24h 200ug LPS 组、72h Sham组、72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组。采用气管内滴注LIPS的方法进行建立急性肺损伤动物模型,Blank组不作任何处理,Sham组予以滴注生理盐水,并于滴注后24h取材。LPS组气道滴注相应剂量的LPS,并在不同时间点进行取材,在造模期间对小鼠的精神状态、活动度、饮食、皮毛情况及体重进行记录;取材时留取肺组织,称取左肺干湿重;取材期间对新鲜肺组织进行外观观察并记录,RT-PCR检测肺组织AQP-1、AQP-5、α ENaC、β ENaC、γENaC、TNF-α、IL-1 β、IL-6、CXCL-1、GM-CSF、CCL-2、CXCL-15、MMP-9、MMP-12的基因表达情况。另取同样处理的小鼠进行气道盥洗液细胞计数。结果:1.小鼠一般情况:Blank组小鼠精神状态佳,呼吸均匀,反应灵敏,毛色油亮光滑,饮食正常。Sham组小鼠术后6h Sham组小鼠状态尚可,呼吸尚均匀,反应尚可,饮食差,毛色较乱;术后24h Sham组小鼠精神状态良好,呼吸均匀,饮食可,毛色正常;术后72h Sham组小鼠精神状态佳,呼吸均匀,反应灵敏,毛色恢复正常颜色,油亮光滑,饮食正常。LPS组小鼠造模后6h,100ug LPS组与200ug LPS组小鼠状态差,呼吸急促,反应迟钝,饮食差,毛色凌乱;造模24h后,100ug LPS组与200ug LPS组小鼠状态差,呼吸急促,伴有喘息及咳嗽,反应迟钝,饮食减少,毛色凌乱发黄;造模72h后,100ug LPS组与200ug LPS组小鼠极差,反应十分迟钝,饮食进一步减少,不欲活动,毛色凌乱发黄无光泽。2.小鼠体重变化:造模后24h,Sham组、100ug LPS组及200ug LPS组体重均减轻,造模后48h,Sham组小鼠体重开始恢复,而100ug LPS组及200ug LPS组体重继续减轻,造模后72h,Sham组小鼠体重已经增加,但100ug LPS组及200ug LPS组体重仍在减轻。3.小鼠湿肺干肺重量比较:湿肺质量比较中,6h Sham组、6h 200ug LPS组较空白组无差异,6h 100ug LPS组较空白组有差异(p<0.05),6h 100ug LPS组、6h 200ug LPS组较6h Sham组无差异;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组较空白组有差异(P<0.01),24h 200ug LPS 组较 24h Sham 组有差异(P<005);72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS 组较空白组有差异(P<0.01),72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组较72h Sham组有差异(P<0.01)。干肺质量比较中,6h Sham组、6h 100ug LPS组、6h 200ug LPS 组较空白组无差异,6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组较 6h Sham组无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组较空白组有差异(P<0.01),24h 100ug LPS组较24h Sham组有差异(P<0.05),24h 200ug LPS组较24h Sham组有差异(P<001);72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组较空白组有差异(P<0.01),72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组较72h Sham组有差异(P<0.01)。肺湿干重比方面,6h LPS组与Blank组比较有差异(P<0.05),24h 100ug LPS组与空白对照组比较有差异(P<0.05),72h LPS组较72h Sham组比较有差异(P<0.05)。小鼠多余肺水量比较中,6h 100ug LPS组较空白组有差异(P<0.01),6h 100ug LPS组较6h Sham组有差异(P<0.05),6h 200ug LPS 组较 6h Sham组无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组较空白组有差异(P<0.01),24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组较 24h Sham组有差异(P<0.05);72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组较空白组有差异(P<0.01),72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组较 72h Sham 组有差异(P<0.01)。4.肺组织 RT-PCR 检测:AQP-1:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank组、6h Sham组比较存在差异(P<0.01),6h Sham组和Blank组比较存在差异(P<0.05);24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组与 Blank 组、24h Sham 组比较存在差异(P<0.01);72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.01),72h 200ug LPS 组与 72h Sham 组比较存在差异(P<0.01)。AQP-5:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),6h 200ug LPS组与6h Sham组比较存在差异(P<0.01);24h 100ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.01),与24h Sham组比较存在差异(P<0.01),24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.05),与24h Sham组比较存在差异(P<0.01);72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异(P<0.01)。α ENaC:6h LPS组较空白对照组及6h Sham组比较无差异;24h Sham组、24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与空白对照组比较无差异,24h LPS组与24h Sham组比较无差异;72h LPS组与空白对照组、72h Sham组比较无差异。β ENaC:6h 100ug LPS组与Blank组比较无差异,与6h Sham组比较存在差异(P<0.05),6h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.05),与6h Sham组比较存在差异(P<0.01);24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.01),24h 100ug LPS组与24h Sham组比较存在差异(P<0.01),24h 200ug LPS组与24h Sham组比较存在差异(P<0.05);72h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.01),72h 200ug LPS组与72h Sham组比较存在差异(P<0.05),72h 100ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较均无差异。γ ENaC:6h Sham组较空白对照组比较存在差异(P<0.05),6h 200ug LPS组较6h Sham组比较存在差异(P<0.05);24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与空白对照组、24h Sham组比较无差异;72h 100ug LLPS组、72h 200ug LPS组与空白对照组、72h Sham组比较无差异。TNF-α:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与Blank 组比较存在差异(P<0.01),与 6h Sham 组比较无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组与Blank 组、24h Sham组比较存在差异(P<0.01),24h Sham组和Blank组比较存在差异(P<0.01);72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异(P<0.01),6h Sham组、24h Sham组与空白组比较有差异(P<0.01)。IL-1 β:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),6h 100ug LPS组与6h Sham组存在差异(P<0.05),6h Sham组和Blank组比较存在差(P<0.05);24h 100ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.05),24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与24h Sham组比较存在差异(P<0.01),24h Sham组和Blank组比较存在差异(P<0.05);在72h组中,72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异(P<0.01)。IL-6:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 6h Sham 组无差异,6h Sham 组和 Blank 组比较差异(P<0.01);24h 100ug LPS组与Blank组、24h Sham组比较存在差异(P<005),24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.05),与24h Sham组比较存在差异(P<0.01);72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组与 Blank 组、72h Sham组比较存在差异(P<0.01)。CXCL-1:6h 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 6h Sham 组无差异;24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS 组与 Blank 组、24h Sham组比较存在差异(P<0.01);72h 100ug LPS组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异(P<0.01)。6h Sham组、24h Sham组与空白组比较存在差异(P<0.o1)。GM-CSF:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),6h 100ug LPS 组与 6h Sham 组比较有差异(P<0.01),6h 200ug LPS 组与 6h Sham组有差异(P<0.05),6h Sham组和Blank组比较有差异(P<0.05);24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.01),24h 200ug LPS组与24h Sham组存在差异(P<0.01),24h 100ug LPS组与24h Sham组存在差异(P<0.05),24h Sham 组和 Blank 组比较存在差异(P<0.05);72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异(P<0.05)。CCL-2:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),6h Sham 组和 Blank 组比较有差异(P<0.05);24h 100ug LPS 组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.01),24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与24h Sham组存在差异(P<0.05),24h Sham组和Blank组比较存在差异(P<0.05);72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),72h 200ug LPS组与72h Sham组比较存在差异(P<0.05),72h 100ug LPS组与72h Sham组比较存在差异(P<0.01)。CXCL-15:6h组与Blank组比较无差异,6h LPS组与6h Sham组比较无差异;24h Sham组、24h LPS组与Blank组比较无差异,24h 200ug LPS组较24h Sham组比较有差异(P<0.05);72h组与Blank组比较无差异,72h LPS组与72h Sham组比较无差异。MMP-9:6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组与 Blank 组比较存在差异(P<0.01),与6h Sham组比较无差异,6h Sham组和Blank组比较存在差异(P<0.01);24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS组与Blank组比较存在差异(P<0.01),24h 200ug LPS组与24h Sham组比较存在差异(P<0.05),24h 100ug LPS组与24h Sham组比较无差异,24h Sham 组和 Blank 组比较存在差异(P<0.05);72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组与Blank组、72h Sham组比较存在差异(P<0.01)。MMP-12:24h LPS组较24h Sham组比较存在差异(P<0.01);72h 100ug LPS较Blank组比较存在差异(P<0.05),余比较无差异。5.新鲜肺组织外观:6h组中,6h Sham组肺组织外观可以大片毛细血管出血点,伴有散在淤点,6h 100ug LPS组小鼠肺组织外观可见肺毛细血管出血点,伴有淤点,甚至融合成斑块,6h 200ug LPS组小鼠肺组织外观可见大片肺毛细血管出血点,伴有大片淤斑。24h组中,24h Sham组小鼠肺组织外观新鲜,可见极少量散在淤点,24h 100ug LPS组小鼠肺组织外观可见肺毛细血管充血水肿,伴有毛细血管破裂出血,可见淤点,甚至融合成斑块,24h 200ug LPS组小鼠肺组织外观可见大片肺毛细血管出血点,伴有大片淤斑。72h组中,72h Sham组小鼠肺组织外观正常,未见明显肺毛细血管充血水肿或出血,未见淤斑淤点,72h 100ug LPS组小鼠肺组织充血水肿明显,肉眼可见肺毛细血管破裂,融合形成淤斑淤点,72h 200ug LPS组小鼠肺组织充血水肿非常明显,肉眼可见破裂的肺组织血管,并融合形成大片的淤斑。6.肺泡灌洗液细胞计数情况支气管肺泡灌洗液总细胞计数:6h 100ug LPS组与Blank组比较有差异(P<0.05),6h 100ug LPS 组、6h 200ug LPS 组和 6h Sham 组比较无差异;24h sham 组与 Blank组比较有差异(P<0.05),24h 100ug L.PS组、24h 200ug LPS组较Blank组、24sham组比较有差异(P<0.01),24h Sham组较Blank组有差异(P<0.05);72h Blank组、72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS 组较 Blank 组比较有差异(P<0.01),72h100ug LPS组、72h 200ug LPS组与72sham组比较存在差异(P<0.01)。支气管肺泡灌洗中性粒细胞计数:6h Sham组、6h 200ug LPS组较Blank组存在差异(P<0.01),6h模型组与6h Sham组比较无差异;24h 100ug LPS组、24h 200ug LPS 组较 Blank 组、24sham组比较有差异(P<0.01);72h 100ug LPS 组、72h 200ug LPS组较Blank组、72hsham组比较有差异(P<0.01)。支气管肺泡灌洗单核巳噬细胞计数:6h组与1Bl ank组比较无差异,6h模型组与6h Sham组比较无差异;24h组与Blank组比较无差异,24h模型组与24h Sham组比较无差异;72h Sham组、72h 100ug LPS组、72h 200ug组与Blank组比较有差异(P<0.01),72h 200ug 组与 72h Sham 组比较有差异(P<0.05)。结论:1.LPS能够诱导小鼠肺湿重、肺干重、多余肺水量的变化,随着时间延长,肺水含量逐渐增多,至72h时间点肺水含量最多,这种变化在在 6h时间点体现不明显,但在24h时间点及72h时间点变化最明显,肺水含量增多即提示肺水肿越严重。对于肺湿干重比的影响,由于LPS对小鼠的肺湿重、肺干重均有影响,所以造成比值差异不大。2.LPS能够抑制AQP-1、AQP-5、β ENaC的基因水平表达,抑制程度与LPS的100ug或200ug的用药量未见明显正相关关系,但24h 100ug LPS及200ug LPS浓度对AQP-1、AQP-5、β ENaC基因表达的抑制最稳定,而LPS达到200ug时,三个时间点对AQP-1、AQP-5、β ENaC基因的表达都有很强的抑制作用。3.LPS能够促进 TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL-1、CCL-2、GM-CSF、MMP-9 等炎症因子、趋化因子及金属蛋白酶的基因表达,这种促进在6h最强,随着时间的推进,这些因子的基因表达逐渐减弱。新鲜肺组织外观比较上看,随着时间的推移,肺损伤淤血面积及水肿程度会逐渐加深,这种损伤会因为LPS的用量增加而表现出更重的趋势。4.不同浓度的LPS在不同时间的干预下,能引起BALB/c小鼠支气管肺泡灌洗液总细胞数目及细胞分类计数的改变。我们可以发现随着时间的推移,BALF细胞总数、中性粒细胞计数和巨噬细胞计数均有所增长,这也提示肺损伤的情况随时间改变呈逐渐加重趋势。5.对Sham组分析发现,气管内滴注手术创伤或者是生理盐水气管内刺激均能导致Sham组的一些指标基因表达异常,且新鲜肺组织外观发生改变,以6h时间点为甚,但在72h是有些指标和Blank组或与之相对应的Sham组比较又无差异,所以取材时间可选择在24h时间点。第三部分 青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠模型的研究(一)目的:在本部分实验中,我们将对青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠ALI模型的研究进行探讨,青天葵总黄酮被分为3个浓度阶梯,分别为40mg/kg、180mg/kg、320mg/kg三个用药组,采用经气管内滴注10mg/kg LPS干预24h建立ALI模型,从小鼠肺湿干重比、多余肺水量、炎症因子、趋化因子、金属蛋白酶的角度来探讨青天葵总黄酮干预急性肺损伤的作用,并通过对肺水转运蛋白和紧密连接蛋白的检测,明确青天葵总黄酮治疗小鼠急性肺损伤的作用机制。方法:将64只BALB/c小鼠随机分为7组,分别是Blank组、Sham组、LPS Model组、40mg/kg 给药(40mg/kg TCM)组、180mg/kg 给药(180mg/kg TCM)组、320mg/kg给药(320mg/kg TCM)组,地塞米松(5mg/kg DEX)组。每天灌胃1次,连续灌胃7天,最后1次给药为造模后30min。Sham组与LPS Model组分别灌胃相同剂量的溶剂,即0.2ml NS。地塞米松(5mg/kg DEX)组给予每只小鼠5mg/kg DEX腹腔注射,即每只小鼠腹腔注射0.1mg DEX/0.1ml NS,腹腔注射为造模后30min进行,空白组不做处理。采用气管内滴注10mg/kg LPS的方式建立模型,干预24h后对小鼠进行取材。左肺行湿重、干重比较,其余肺组织-80℃冷冻,RT-PCR检测AQP-1、AQP-5、α ENaC、β ENaC、γ ENaC、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-18、Occludin、Z0-1、TNF-α、IL-1β、IL-6、CXCL-1、GM-CSF、MMP9 等指标。结果:1.肺干重湿重比较:在湿重比较中,LPS组与Sham组比较存在差异(P<0.01);180mg/kg组较LPS组存在差异(P<0.01),其余用药组与LPS组比较无差异。干重比较中,LPS组与Sham组比较存在差异(P<0.01),用药组与LPS组无差异。W/D组中,LPS组与Sham组比较存在差异(P<0.01);180mg/kg组较LPS组存在差异(P<0.01),其余用药组与LPS组比较无差异。多余肺水量比较中,LPS组与Sham组比较存在差异(P<0.01);180mg/kg组较LPS组存在差异(P<0.01),其余用药组与LPS组比较无差异。2.肺组织RT-PCR 比较:Occludin:LPS组较Sham组存在差异(P<0.01),180mg/kg TCM组较LPS组存在差异(P<0.05),5mg/kg DEX组较LPS组存在差异(P<0.01)。TNF-α 及 IL-1 β:LPS 较 Sham 组存在差异(P<0.01),与 180mg/kg TCM组比较有差异(P<0.05)。AQP-1、AQP-5、α ENaC、βENaC、γENaC、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-18、Z0-1、IL-6、CXCL-1、GM-CSF、MMP9 基因表达情况未见差异。结论:青天葵总黄酮能够降低肺湿干重比及多余肺水量,从而缓解LPS诱导的急性肺损伤BALL1B/c小鼠肺水肿情况,其机制可能是通过升高紧密连接蛋白Occludin的基因表达,降低TNF-α、IL-1β的基因表达来实现的。第四部分 青天葵总黄酮干预急性肺损伤BALB/c小鼠模型的研究(二)目的:探讨青天葵总黄酮对急性肺损伤BALB/c小鼠ALI模型肺组织病理学、支气管肺泡灌洗液计数、Occludin的蛋白表达的影响。方法:将32只SPF级BALB/c小鼠随机分为4组,其中Sham组8只、Sham+180mg/kg TCM组 8 只,LPS Model 组 8 只,LPS+180mg/kg TCM 给药组 8 只。Sham+180mg/kg TCM 组及LPS+180mg/kg TCM给药组小鼠给予3.6mg青天葵总黄酮/0.2ml NS灌胃,Sham组和LPS Model组给予0.2ml NS灌胃,每日1次,连续7天,最后1次给药为造模后30min。采用气管内滴注1Omg/kg LPS的方式建立模型,干预24h后对小鼠进行取材。右肺中叶多聚甲醛固定,行HE切片,留取小鼠BALF,行总细胞计数及分类计数,剩余肺组织-80℃冻存,待检Occludin蛋白表达情况。结果:1.支气管肺泡灌洗液细胞计数比较:支气管肺泡灌洗液总细胞计数比较:LPS组较Sham组比较存在差异(P<0.01),LPS+TCM组较LPS组比较存在差异(P<0.05)。支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数比较:LPS组较Sham组比较存在差异(P<0.01),LPS+TCM组较LPS组比较存在差异(P<0.01)。气管肺泡灌洗液巨噬细胞计数比较:LPS组较Sham组比较无差异(P>0.05),LPS+TCM组较LPS组比较无差异(P>0.05)。2.肺组织病理学及评分:Sham组及Sham+LPS组肺HE切片可见肺组织结构完整,未见肺水肿,可见巨噬细胞及少量中性粒细胞,LPS组肺HE切片可见肺组织结构遭到破坏,肺间质水肿明显,伴有大量中性粒浸润,肺泡出现塌陷,且存在肺不张,LPS+TCM组损伤程度低于LPS组。评分结果显示,LPS组评分较Sham组比较,存在差异(P<0.01),LPS+TCM组较LPS组存在差异(P<0.01)。3.Western Blot检测Occludin的蛋白表达:LPS组Occludin蛋白表达量低于Sham组,较Sham组存在差异(P<0.01),LPS+TCM组Occludin蛋白表达量高于LPS组,较LPS组存在差异(10<0.01)。结论:青天葵总黄酮能够通过降低支气管肺泡灌洗液中的总细胞数及中性粒细胞数,改善肺组织病理学,促进肺组织中紧密连接蛋白Occludin的蛋白表达,从而起到保护LPS所诱导的ALI的作用。