第一部分小鼠前交叉韧带切断诱导骨关节炎模型目的:构建前交叉韧带切除(anterior cruciate ligament transection,ACLT)的小鼠骨关节炎(osteoarthritis,OA)模型。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术。于术后第8周收取小鼠膝关节,制作石蜡切片,Alcian blue/hematoxylin&orange G(AB/H&OG)染色,显微镜下拍照,同时进行胫骨软骨和软骨下骨的OARSI评分。结果:术后8周病理学组织切片显示ACLT组软骨严重磨损,OARSI评分明显高于对照组。结论:该实验采用ACLT方法成功建立了小鼠膝关节OA模型,且造模后8周内的病理形态学改变类似于人类膝关节晚期OA表现。第二部分小鼠骨关节炎使用淫羊藿苷后胫骨软骨和软骨下骨的组织学分析目的:通过早期或晚期应用淫羊藿苷(icariin,ICA)治疗小鼠OA,进行小鼠胫骨OA软骨和软骨下骨的组织学分析,观察其病理改变以及ICA对OA小鼠胫骨软骨和软骨下骨的保护作用。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术,构建前交叉韧带切除的小鼠OA模型。分别于术后0周和4周开始将ICA灌胃使用(10mg/kg/day)。于术后第8周收取小鼠膝关节,制作石蜡切片,Alcian blue/hematoxylin&orange G(AB/H&OG)染色,显微镜下拍照。用计算机软件Image J计算胫骨软骨区域的面积。观察透明软骨和钙化软骨的厚度。运用骨形态计量学软件Bioquant计算小鼠胫骨软骨下骨板(绿色线条圈出的区域)的平均厚度。结果:(1)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨缺失明显。ICA早期给药组胫骨软骨的缺失程度明显轻于未给药对照组。ICA晚期给药组胫骨软骨的缺失程度与未给药对照组相仿。(2)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨OARSI评分显著增高(P<0.01)。ICA早期给药组OARSI评分明显低于未给药对照组(P<0.05)。JCA晚期给药组OARSI评分与未给药对照组相比无显著性差异。(3)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨残存软骨面积显著减小(P<0.01)。ICA早期给药组胫骨残存的软骨面积占假手术组的面积比例明显高于未给药对照组。ICA晚期给药组胫骨残存的软骨面积占假手术组的面积比例与未给药对照组相比无显著性差异。(4)OA晚期小鼠胫骨透明软骨和钙化软骨磨损严重,软骨下骨暴露。术后8周,ICA早期给药组仍可清晰辨认胫骨透明软骨和钙化软骨层;术后8周,ICA晚期给药组胫骨透明软骨层消失,残留少许钙化软骨层。(5)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨板平均厚度明显增厚(P<0.05)。ICA早期给药组胫骨软骨下骨板平均厚度明显薄于未给药对照组,ICA晚期给药组胫骨软骨下骨板平均厚度与未给药对照组相比无显著性差异。结论:在小鼠OA模型中:(1)OA晚期胫骨软骨缺损严重,软骨下骨暴露,软骨下骨板增厚。(2)ICA对OA胫骨软骨(透明和钙化软骨)有保护作用,并能防止软骨下骨板增厚。(3)ICA药物作用效果与给药时间有关系,早期治疗效果优于晚期治疗。第三部分小鼠骨关节炎使用淫羊藿苷后血清骨代谢标志物的含量目的:通过早期和晚期应用ICA治疗小鼠OA,观察ICA对小鼠血清骨代谢标志物的影响。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术,构建前交叉韧带切除的小鼠骨OA模型。分别于术后0周和4周开始将ICA灌胃使用(10mg/kg/day)。于术后第8周收集小鼠全血,制备血清,采用ELISA法测定血清中C-telopeptide of typteⅠcollagen(CTX)、Osteocalcin(OC)、IL-6、TNF-α和 IL-1β的含量。结果:(1)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠的血清CTX含量显著降低(P<0.05)。无论是早期给药还是晚期给药,ICA均能显著增高OA小鼠血清CTX的含量(P<0.05)。(2)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠的血清OC含量显著降低(P<0.05)。ICA早期给药能显著升高OA小鼠血清OC的含量(P<0.05),ICA晚期给药组血清OC的含量与未给药对照组相比无显著性差异。(3)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠的血清IL-6含量显著升高(P.<0.05)。与未给药对照组相比,,ICA早期给药组血清IL-6的含量显著降低(p<0.05),ICA晚期给药组血清IL-6的含量与未给药对照组相比无显著性差异。(4)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠的血清TNF-α含量显著升高(P<0.05)。与未给药对照组相比,无论是早期给药还是晚期给药,ICA均不能显著降低血清TNF-α的含量。(5)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠的血清IL-1β含量显著升高(P<0.05)。与未给药对照组相比,无论是早期给药还是晚期给药,ICA均不能显著降低血清IL-1β的含量。结论:在小鼠OA模型中:(1)OA晚期软骨下骨骨改建能力降低,骨转换率下降,血清CTX和OC水平下降。(2)OA晚期血清IL-6、TNF-α和IL-1β水平升高。(3)ICA能增强OA软骨下骨骨转换能力,且早期治疗效果明显。(4)ICA早期治疗能降低OA血清IL-6的水平,但对TNF-α和IL-1β等细胞因子的表达无调控作用。(5)血清IL-6与软骨破坏程度可能具有相关性;血清TNF-α和IL-1β水平与软骨的破坏程度可能不存在相关性。第四部分小鼠骨关节炎使用淫羊藿苷后软骨标志基因的表达目的:通过早期和晚期应用ICA治疗小鼠OA,观察ICA对小鼠胫骨软骨标志基因表达的影响。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术,于术后0周(早期给药组)和第4周(晚期给药组)开始将ICA灌胃使用(10mg/kg/day)。于术后第8周收集小鼠胫骨近端关节软骨,提取总RNA,应用定量RT-PCR检测Mmp家族成员Mmp1,2,3,8 和 13 以及 Adamts5,IL-1β和 TNF-α的 mRNA 表达。结果:(1)与假手术对照组相比,OA晚期软骨Mmp1,3,8和13的表达显著增高(P<0.05)。与未给药对照组相比,ICA早期给药组的软骨Mmp1,3,8和13的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。(2)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠软骨中Adamts5,IL-Iβ和TNF-α的mRNA表达显著增高(P<0.05)。与未给药对照组相比,ICA早期给药组的软骨Adamts5,IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。(3)与未给药对照组相比,ICA晚期给药组的软骨Mmp1,3,8的mRNA表达水平无显著性差异,Mmp13的表达水平显著降低(P<0.05)。(4)与未给药对照组相比,ICA晚期给药组的软骨Adamts5,IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平无显著性差异。结论:在小鼠OA模型中:(1)OA 晚期,软骨 Mmp1,3,8 和 13 以及 Adamts5,IL-1β和 TNF-α的 mRNA 表达增高。(2)ICA 能显著降低软骨 Mmp1,3,8 和 13 以及 Adamts5,IL-1β和 TNF-α的 mRNA表达。(3)ICA药物作用效果与给药时间有关系,早期治疗效果明显好于晚期治疗。第五部分淫羊藿苷对骨关节炎小鼠胫骨软骨下骨骨髓基质细胞的影响目的:早期应用ICA治疗小鼠OA,分离小鼠胫骨软骨下骨骨髓基质细胞(Bone Marrow stromal Cells,BMSCs)进行体外培养,检测ICA对小鼠胫骨软骨下骨BMSCs成骨分化潜能、矿化能力和合成胶原蛋白能力的影响。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术,于术后0周开始将ICA灌胃使用(10mg/kg/day)。于术后第8周,收集小鼠胫骨近端软骨下骨,分离其中的BMSCs:(1)接种于10-cm培养皿,体外成骨诱导25天,行Vonkossa’s染色,最后显微镜下计量成骨细胞-集落形成数目;(2)流式细胞术检测其中Nestin和Osterix阳性细胞的比例;(3)用BMP-2诱导其向成骨细胞定向分化,4周之后行茜素红染色,显微镜下拍照,之后将茜素红洗脱,分光光度计定量;(4)提取总RNA和总蛋白,用定量RT-PCR和western blot检测Col1A1和Col1A2的mRNA和蛋白质的表达量,并计算二者的比值。(5)收取小鼠膝关节,制作石蜡切片,针对Nestin和Osterix进行免疫组化染色,显微镜下拍照。结果:(1)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs成骨细胞-集落形成数目明显增多(P<0.05)。与未给药对照组相比,ICA治疗后成骨细胞-集落形成数目明显下降(P<0.05)。(2)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs标志基因Nestin和Osterix表达显著增多(P<0.05)。与未给药对照组相比,ICA治疗后BMSCs标志基因Nestin和Osterix表达显著下降(P<0.05)。(3)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中Nestin和Osterix阳性细胞比例显著增高(P<0.05)。与未给药对照组相比,ICA治疗后BMSCs中Nestin和Osterix阳性细胞比例显著下降(P<0.05)。(4)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨茜素红染色的成骨细胞矿化骨结节数目显著下降(P<0.05)。与未给药对照组相比,ICA早期给药后,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨茜素红染色的成骨细胞矿化骨结节数目显著增多(P<0.05)。(5)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨Col1A1和Col1A2的mRNA和蛋白质的表达量显著增高(P<0.05);二者的比值也显著增高(P<0.05)。与未给药对照组相比,ICA治疗后Col1A1和Col1A2的mRNA和蛋白质的表达量显著降低(P<0.05),二者的比值也显著下降(P<0.05)。结论:在小鼠晚期OA模型中:(1)胫骨软骨下骨BMSCs的成骨分化能力增强,ICA能抑制BMSCs的成骨分化能力。(2)胫骨软骨下骨BMSCs中Nestin和Osterix表达增高,ICA能抑制Nestin和Osterix表达。(3)胫骨软骨下骨BMSCsI型胶原合成能力增强,但Col1A1/Col1A2比例增高,软骨下骨矿化功能障碍。ICA能抑制胫骨软骨下骨BMSCs合成I型胶原,降低Col1A1/Col1A2比例,改善软骨下骨矿化障碍。第六部分淫羊藿苷影响骨关节炎小鼠胫骨软骨下骨骨髓基质细胞的分子机制目的:早期应用ICA治疗小鼠OA,探讨ICA影响小鼠胫骨软骨下骨BMSCs的分子机制。材料与方法:8周龄雄性C57BL/6J小鼠行前交叉韧带切断术,于术后0周开始将淫羊藿灌胃使用(10mg/kg/day)。于术后第8周收集小鼠胫骨近端软骨下骨,分离其中的BMScs:(1)提取总蛋白,用Antibody array检测36种常见骨代谢标志物的表达量,荧光强度代表特定标志物的表达水平;(2)提取总RNA和总蛋白,利用定量RT-PCR和ELISA检测细胞中TGF-β1的mRNA和蛋白质表达水平;(3)收取小鼠膝关节,制作石蜡切片,针对TGF-β1进行免疫组化染色,显微镜下拍照;(4)进行体外培养,将β-连环蛋白的Topflash载体和Renilla luciferase载体共转染进入细胞,之后检测两种荧光素酶载体的活性;(5)进行体外培养,用BMP-2诱导细胞矿化,向培养基中加入ICA、TGF-β1和/或DKK2,4周之后行茜素红(矿化骨结节)染色,显微镜下拍照,之后将茜素红洗脱,分光光度计定量;(6)进行体外培养,向培养基中加入ICA、TGF-β1和/或DKK2,提取总蛋白,用western blot检测Col1A1和Col1A2的蛋白质的表达量,并计算二者的比值。结果:(1)与未给药对照组相比,ICA早期给药后,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs TGF-β1的表达量明显下降(P<0.05)。(2)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCsTGF-β1的mRNA和蛋白质表达水平显著增高(P<0.05);与未给药对照组相比,ICA早期给药后,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs TGF-β1的mRNA和蛋白质表达水平显著下降(P<0.05)。(3)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中DKK2的mRNA和蛋白质表达水平显著增高(P<0.05);与未给药对照组相比,ICA早期给药后,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中DKK2的mRNA和蛋白质表达水平显著下降(P<0.05)。(4)与假手术对照组相比,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中β-连环蛋白的两种荧光素酶载体(Topflash和Renilla luciferase)的活性显著下降(P<0.05);与未给药对照组相比,ICA早期给药后,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中β-连环蛋白的两种荧光素酶载体(Topflash和Renilla luciferase)的活性显著增强(P<0.05)。(5)与未给药对照组相比,ICA早期给药后,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中茜素红染色的成骨细胞矿化骨结节数目显著增多(P<0.05);加入TGF-β1或DKK2后,茜素红染色的成骨细胞矿化骨结节数目显著下降(P<0.05)。(6)与未给药对照组相比,ICA早期给药后,OA晚期小鼠胫骨软骨下骨BMSCs中Col1A1和Col1A2的蛋白质的表达量下降,二者的比值也显著下降(P<0.05);加入TGF-β1或DKK2后,Col1A1和Col1A2的蛋白质表达量显著升高(P<0.05),二者的比值也显著升高(P<0.05)。结论:在小鼠OA晚期模型中:(1)软骨下骨BMSCsTGF-β1的分泌量显著增高;ICA能降低TGF-β1的分泌。(2)软骨下骨BMSCs中DKK2的表达水平增高;ICA能降低DKK2的表达。(3)软骨下骨BMSCs中β-连环蛋白的活性下降;ICA能增强β-连环蛋白的活性。(4)ICA能调控OA胫骨软骨下骨BMSCs Ⅰ型胶原的合成,而TGF-β1和DKK2能抑制ICA导致的上述胶原合成调控作用。(5)ICA能增强OA胫骨软骨下骨BMSCs的矿化能力,而TGF-β1和DKK2能抑制ICA导致的上述矿化增强作用。根据我们的实验结果,推测ICA治疗OA的分子作用机制如下:OA软骨下骨矿化障碍,ICA可以降低BMSCs TGF-β1的分泌量,继而下调Wnt/β-连环蛋白信号通路抑制因子DKK2的表达,从而上调了 Wnt/β-连环蛋白信号通路的活性,一定程度上纠正了OA软骨下骨的矿化障碍,发挥了对OA软骨下骨的保护作用。