研究背景:近年来研究表明,感染流感病毒的重症及死亡病例中有50%~90%与细菌共感染有关。目前已报道能与流感病毒发生共感染的细菌有十多种,其中最为常见的有3种,分别是肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌及肺嗜血杆菌。研究表明,金葡菌与流感病毒共感染的死亡率最高。深入研究共感染过程中的致病机制,对于降低死亡率有重要意义。以往研究表明,在共感染的重症与死亡病例中常伴有严重的肺部炎症反应。而补体在许多疾病中被证明与炎症损伤有关,那么补体是否在流感病毒/细菌共感染所致炎症反应中也起关键作用?目前这一问题尚不清楚,亦未见相关研究报道。因此,我们选择以流感病毒和金葡菌构建共感染小鼠模型,拟研究补体在共感染过程中的激活情况及其在致严重肺炎中的作用。目的和意义:从机体的补体调节方面研究流感病毒/金葡菌共感染导致高死亡率的致病机制,探索补体调节作为治疗共感染的可能性,为临床上制定流感病毒/细菌共感染病例治疗方案提供理论依据,从而最终达到降低死亡率的目的。研究方法:以亚致死剂量的流感病毒(PR8株)与耐药金黄色葡萄球菌(MRSA,简称金葡菌)建立共感染小鼠模型。利用不同的感染时机与次序等多种共感染策略,筛选出高死亡率共感染模型。通过病理切片、ELISA等方法检测小鼠肺部炎症病理反应及炎症相关细胞因子的表达水平,特别是与补体相关炎性因子C3a与C5a的表达水平。利用免疫荧光技术检测补体C3d蛋白分子在肺组织的沉积水平,检测流感病毒与金葡菌在肺脏的分布及病原载量情况。最后利用补体缺陷(C3-/-,C5-/-,MBL-/-)、补体抑制(c3ar-/-,c5ar抗体)及补体耗竭(cvf)等手段建立共感染小鼠模型,观察肺部炎症损伤程度与死亡率的变化等情况。结果:小鼠仅在感染流感病毒0d~3d后感染金葡菌的死亡率最高(>80%),而其它共感染组的死亡率均较低,特别是先感染细菌后感染病毒组的死亡率<40%。与对照组相比,高死亡率实验组小鼠的体重也呈明显下降趋势。病理组织切片分析结果表明,d-2组小鼠肺组织损伤面积达约90%,肺指数也明显升高,均明显高于对照组;同时伴有炎症细胞(淋巴细胞和粒细胞)浸润、肺泡萎缩或实质化及邻近肺泡融合或代偿性扩张形成较大囊腔的肺大泡。d-2组小鼠血清中tnf-α、il-6、il-8、ifn-γ等炎症相关因子水平明显高于对照组,特别是与补体相关炎性因子c3a和c5a的表达量明显升高。组织免疫荧光检测结果表明,共感染小鼠(d-2组)肺组织有大量的补体c3d蛋白分子沉积,甚至漫延至整个肺部,明显多于其它对照组。补体三条通路的起始因子水平检测结果表明,在共感染组(d-2组)小鼠死亡高峰期,经典途径的起始因子c1q在d-2组小鼠肺部大量沉积,明显高于对照组;旁路途径起始因子cfba与甘露糖-凝集素途径起始因子masp-2在血清中的水平均明显高于对照组(p<0.00001,p<0.001)。补体调节蛋白检测结果表明,共感染高死亡率组小鼠血清中补体负性调节蛋白(cfh、cfi、crry、cr1、cd59、c4bp、daf)的含量较对照组均有明显下调,但正性调节蛋白(cfp、nef)下调无显著差异。c3-/-或c5-/-补体缺陷小鼠共感染生存率均为100%,体重恢复良好且肺部无明显损伤情况。过敏毒素c3a受体缺陷小鼠(c3ar-/-)共感染生存率率上升约50%,甘露糖凝集素缺陷小鼠(mbl-/-)共感染生存率上升约70%。眼镜蛇毒因子(cvf)耗竭补体结果表明,与对照组相比,治疗组生存率上升了近60%,且体重也有显著地恢复。过敏毒素c5a受体抗体(anti-c5ar)治疗共感染小鼠结果表明其生存率为70%,明显高于野生型小鼠对照组。结论:成功建立了流感病毒/金葡菌共感染高死亡率小鼠模型,共感染的死亡率与两种病原的感染次序及感染时机明显相关,即小鼠仅在先感染流感病毒0d~3d后再感染金葡菌的死亡率最高(>80%),明显高于其它共感染组。高死亡率共感染组小鼠的肺脏均伴有明显的病理变化和严重的炎症反应,提示严重的肺炎反应是造成高死亡率的重要原因之一。高死亡率共感染组小鼠严重肺炎进程中伴有补体过度激活,其中三条补体通路均被激活,提示补体的过度激活是造成肺部严重炎症反应的重要原因之一。补体的过度激活不仅与补体负性调节蛋白(CFH、CFI、Crry、CR1、CD59、C4BP、DAF)表达减少有关,而且两种病原在小鼠肺部载量的增多与补体激活水平呈正相关。通过补体缺陷(C3-/-,C5-/-,MBL-/-)、补体抑制(C3aR-/-,C5aR抗体)及耗竭(CVF)等多种调节方式去除补体影响后,均能不同程度减缓共感染小鼠肺部炎症反应、恢复病理损伤,且能降低死亡率,表明补体的过度激活是共感染致严重肺部炎症反应的原因之一。研究结果提示补体的抑制性调节可作为流感病毒/细菌共感染治疗的一条潜在途径。