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细胞色素P450(cytochromeP450，简称CYP450)是一类重要的亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族，由多种同工酶组成，在生物体内广泛参与多种内源性物质的生物合成与降解，以及一些外源性化合物的代谢转化。近年来，畜禽产品中有害物质和药物残留逐渐成为食品安全监控的重点。研究表明人CYP3A4是一种普遍存在于肝脏和肠上皮细胞的药物代谢关键酶，参与体内固醇类激素的生物合成，如雌雄激素之间的生物转换。猪的细胞色素P4503A29和人CYP3A4的DNA序列相似性为77％，两者在活性与结构的关键氨基酸位点上存在高度保守，且本实验室前期基因芯片研究表明，经过T2毒素处理的猪原代肝细胞中CYP3A29表达上调，因此我们推测，CYP3A29可能是猪体内承担外源化合物代谢的关键酶。 本研究通过体外在大肠杆菌中重组表达猪细胞色素3A29并纯化取得单一酶组分，利用P450s在450nm处的特征吸收峰来确定重组蛋白的活性，用脂质体、细胞色素P450还原酶、CYP B5还原酶等组分在体外模拟重组P450s在体内的反应体系，并与人CYP3A4的经典模式底物尼福地平和睾丸酮来验证猪CYP3A29的活性，利用尼福地平来测定重组CYP3A29的代谢动力学参数，并将该重组酶与体外毒素T2孵育，利用HPLC-MS检测其代谢产物；第二部分内容主要根据人CYP3A4的催化位点来设计CYP3A29的突变体来验证其关键位点与酶的催化特征之间的关系。通过参考文献，得出Leu211位点和Phe304位点对于人CYP3A4的结构与催化活性影响较为重要，因此选取该两个位点对猪CYP3A29进行突变，以考察重组酶的活性变化；此外，还参照人CYP3A4相对应的氨基酸对猪CYP3A29的Lys212和Ser214位点进行突变，一共六个突变体被用来考察猪CYP3A29关键位点与酶的催化特征之间的关系。 测得重组的猪CYP3A29动力学参数Km值：146.32435±69.1646μM和Vmax∶1.73621±0.30927 nmol min-1mg-1protein，并且该重组酶能够将毒性较大的外源毒素T2代谢成毒性较低、可溶性增大的3羟基-T2。在六个突变体中，Leu211和Phe304两个位点的四个突变对于CYP3A29代谢尼福地平的影响较大，突变后产物生成量降低到野生型的20％以下；而对于睾丸酮代谢来说，Leu211和Phe304位点的突变使猪CYP3A29出现不同的底物空间选择性：211位点的突变倾向于使CYP3A29催化睾丸酮生成2β-羟基化睾丸酮，而304位点的突变倾向于使CYP3A29催化睾丸酮生成6β-羟基化睾丸酮，此外，圆二色谱检测结果显示各个重组蛋白均具有典型的α-螺旋结构；其中211位点的突变导致突变体蛋白的α-螺旋含量降低到野生型的50％左右。 本研究利用大肠杆菌系统原核表达并纯化了具有天然构象和催化活性的猪CYP3A29重组酶蛋白，利用3A家族经典模式底物尼福地平测定了重组酶的代谢动力学参数。为了解猪CYP3A29催化的关键氨基酸残基，通过与人CYP3A4比对，我们构建了一系列突变体。通过测定其与尼福地平和睾丸酮两种底物的催化活性，探究猪3A29结构与功能的相互关系。通过研究我们发现猪CYP3A29序列中Leu211和Phe304对于CYP3A29代谢尼福地平的影响较大，基本将产物生成量降低到野生型的20％以下；而对于睾丸酮代谢来说，Leu211和Phe304的突变使猪CYP3A29呈现不同的底物空间选择性，这些结果为进一步深入探讨关键CYP P450酶的结构与功能打下坚实的基础。