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该课题研究内容包括两个方面:1、基底前脑神经干细胞的分离、培养和鉴定.2、神经干细胞移植后在体内的存活、迁移和分化以及神经干细胞移植治疗AD模型鼠的疗效观察.第一部分新生鼠神经干细胞的分离、培养以及鉴定.一、材料和方法新生的SD大鼠的基底前脑,机械分离,然后在胰蛋白酶中消化分散,制成单细胞悬液,加入含2％B27、表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)(终浓度均为1ong/ml)的DMEM/F12培养基,放置在37℃、5％C0<,2>培养箱内培养.待原代克隆形成后机械分离成单细胞悬液,按上述条件继续培养.以后每5~7天分离克隆传代一次,方法同前.用10％的小牛血清诱导贴壁的神经干细胞分化.将BrdU加入传代培养的细胞培养基中,终浓度为6ug/ml.用免疫细胞化学方法,行Nestin、NF、GFAP、BrdU染色,鉴定培养细胞的增殖能力和分化潜能.二、结果基底前脑神经干细胞能够在EGF和FGF-2的刺激下分裂增殖,1周左右形成由数十到数百个细胞组成的细胞球.传代培养的神经干细胞具有与原代培养的神经干细胞相同的生物学特性.基底前脑神经干细胞能够分化为神经元和神经胶质细胞,分别呈NF、GFAP阳性.克隆细胞球染色,显示Nestin和BrdU标记阳性反应.免疫荧光双标检测,贴壁的细胞为BrdU+GFAP阳性反应或者BrdU+NF阳性反应.第二部分神经干细胞移植治疗AD模型鼠.一、材料和方法:雄性SD大鼠(250-300g),单侧切断穹隆海马伞(Fimbria-fornix,FF),以制备隔-海马通路损伤的AD模型.动物共分3组:①正常对照组(正常组)6只;②FF损伤组(损伤组)6只;③神经干细胞移植组16只.大鼠切断FF,将神经干细胞4ul(2.5X10<4>个/μ1)移植入基底前脑,坐标为:前囟(anterior-posterior,AP)+0.6mm,外侧(1ateral,L)+0.6mm插入,腹侧(dorsal-ventral.DV)-5.5mm.分别在1、2、3、4周检测神经干细胞在体内的存活、迁移和分化情况.4周后对各组动物进行Y-迷宫空间学习记忆能力的检测.行为检测后将动物处死,取脑,冰冻切片,进行NGFR、小白蛋白(PV)免疫组化染色.对内侧隔核(MS)、斜角带核(VDB)的NGFR阳性神经元和PV阳性神经元进行计数和形态学参数的测定.并用SPSS统计软件包进行统计学处理.二、结果:1、神经干细胞在体内的存活、迁移和分化结果显示,移植后1周,大部分移植细胞聚集在移植的针道附近,结果显示Nestin阳性,细胞胞体较小,向四周伸出突起.移植后2周,细胞向附近的脑组织迁移,部分细胞迁移到相对较远的地方,部分细胞与周围组织整合,Nestin阳性细胞数明显减少.移植后3周、4周,看不到Nestin阳性细胞;抗BrdU+抗NF和抗BrdU+抗GFAP免疫荧光双标染色显示,移植的针道附近以及整个基底前脑散在有许多抗BrdU+抗NF和抗BrdU+抗GFAP免疫荧光双标阳性细胞.2、神经干细胞移植对AD模型鼠基底前脑NGFR阳性神经元的影响FF切断4周后,损伤组损伤侧的MS和VDB的NGFR阳性神经元大量减少,分别减少59.7％和51.4％.NSC移植组损伤侧的NGFR阳性神经元得到补充和补充和保护,MS和VDB细胞数分别下降22.0％和26.1％.NSC移植组损伤侧MS的NGFR阳性神经元的面积、周长显著增大(p<0.01),灰度显著增加(p<0.01);损伤侧VDB的NGFR阳性神经元的面积明显增大(p<0.05),灰度明显增加(p<0.05),周长显著增大(p<0.01).3、神经干细胞移植对AD模型鼠基底前脑PV阳性神经元的影响穹窿-海马伞切断四周后,损伤组损伤侧的MS和VDB的PV阳性神经元大量减少,分别减少62.5％和30.4％.NSC移植组损伤侧的PV阳性神经元得到补充和补充-3-和保护,MS和VDB细胞数分别下降22.5％和14.4％.NSC移植组损伤侧MS的PV阳性神经元的面积、周长明显增大(p<0.05),灰度显著增加(p<0.01);损伤侧VDB的PV阳性神经元的面积明显增大(p<0.05),灰度明显增加(p<0.05),周长显著增大(p<0.01).4、神经干细胞移植对AD模型鼠空间学习记忆能力的影响Y型迷宫测试3组大鼠空间学习记忆能力,正常组平均学习次数为53.33次,平均正确记忆次数为8.2次;损伤组的平均学习次数为98.33次,平均正确记忆次数为4.0次,显示损伤组大鼠空间学习能力明显下降,(P<0.05),记忆能力显著下降(P<0.01);NSC移植组的的平均学习次数为73.20次,平均正确记忆次数为6.9次,显示NSC移植组的空间学习能力得到改善(P<0.05),记忆能力得到显著提高(P<0.01);与正常组相比未见差异(P>0.05).从以上来看,基底前脑NGFR阳性细胞数和PV阳性细胞数与大鼠的空间学习记忆能力呈正相关,即基底前脑内NGFR阳性细胞数和PV阳性细胞数减少越多,大鼠的空间学习记忆能力损害越严重.小结.1、基底前脑存在神经干细胞,能够利用无血清的培养基在EGF和FGF-2刺激下从基底前脑组织中培养获得.基底前脑神经干细胞是具有自我更新能力、多分化潜能的细胞,可以分化为神经元和胶质细胞.2、基底前脑神经干细胞能够在宿主脑内存活、迁移和分化,能够较好地与宿主脑组织整合;并且能够根据宿主脑组织的微环境分化为组织特异性的神经细胞,如胆碱能神经元和GABA能神经元.-4-3、单侧切断FF后,基底前脑MS、VDB的NGFR阳性神经元和PV阳性神经元都大量丢失.MS、VDB的NGFR阳性神经元和PV阳性神经元的丢失与AD模型大鼠的空间学习记忆障碍密切相关.4、神经干细胞移植治疗对AD模型鼠基底前脑NGFR阳性神经元和PV阳性神经元有明显的补充和保护作用.5、神经干细胞移植治疗能够明显提高AD模型鼠的空间学习记忆能力.