【摘 要】
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目的:(1)克隆全长的TMEFF2基因,构建真核基因表达载体;(2)构建TMEFF2基因RNA干扰载体;(3)对蛋白进行亚细胞定位;(4)筛选并建立稳定的基因过表达与低表达细胞株,通过检测这两
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目的:(1)克隆全长的TMEFF2基因,构建真核基因表达载体;(2)构建TMEFF2基因RNA干扰载体;(3)对蛋白进行亚细胞定位;(4)筛选并建立稳定的基因过表达与低表达细胞株,通过检测这两种细胞株生长特性的变化,初步推断蛋白的功能。
方法:实验分为两个部分:(1)将克隆好的全长TMEFF2基因连接入pEGFP-N2载体,以脂质体包裹重组质粒转染SH-SY5Y细胞,在细胞中可表达生成TMEFF-EGFP融合蛋白,经G418筛选建立TMEFF2过表达细胞株,同时筛选出作为对照的pEGFP-N2稳定转染细胞株。以MTT法测定TMEFF2过表达细胞株和pEGFP-N2稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞的增殖性。同时用激光共聚焦显微镜对TMEFF2基因所表达的蛋白进行亚细胞定位。(2)设计并构建2种针对TMEFF2的RNA干扰载体,转染入SH-SY5Y细胞,经G418筛选建立TMEFF2低表达细胞株,同时筛选出作为对照的pSuper-EGFP稳定转染细胞株。通过实时荧光定量PCR检测出干扰效果较好的低表达细胞株,再以MTT法测定该细胞株和pSuper-EGFP稳定转染细胞株以及SH-SY5Y细胞的增埴性。
结果:(1)成功构建真核表达质粒pEGFP-TMEFF2,pEGFP-RNAi1和pEGF-RNAi2。(2)实时荧光定量PCR检测得到pEGFP-RNAi1的干扰效果较好:(3)TMEFF2-EGFP融合蛋白表达于细胞膜;(4)筛选并建立了稳定的基因过表达与低表达细胞株;(5)在细胞密度较高时,TMEFF2过表达细胞株的增殖较对照组及SH-SY5Y细胞株均明显降低;(6)同样在细胞密度较高时,TMEFF2低表达细胞株增殖较对照组及SH-SY5Y细胞株均明显增高
结论:(1)TMEFF2表达的蛋白为膜蛋白:(2)TMEFF2基因可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖,且抑制作用具有明显密度依赖性。
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