传染性疾病可由多种病原引起,包括病毒、细菌、真菌、原虫和蠕虫,易大规模爆发流行,防治困难,给社会和国家带来严重后果。尤其是病毒性传染病,如目前肆虐的埃博拉病毒、流感病毒H7N9以及有着大量感染人群的乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等,由于其易于传播且缺乏有效的治疗手段,因此如何快速准确地对病毒传染性疾病进行筛查,以便及早切断传播途径,是传染性疾病防治工作的重要课题。至今为止,对病毒传染性疾病的诊断已经从病毒、核酸和蛋白等不同层次发展了多种检测方法,主要包括病毒分离、核酸检测和生物标志物检测。然而,基于现有的感染标志物的检测结果仍不能令人完全满意,寻求新的生物标记物对于传染性疾病防控仍具有重要意义。microRNA (miRNA)是一种只有约22个核苷酸(nt)的非编码小分子RNA,广泛存在于动植物真核细胞中。目前,随着实验技术的发展及miRNA研究的不断深入,已发现了28000多种miRNA,其中2500多种为成熟体的人编码miRNA。 miRNA主要通过与靶mRNA分子的3’端非编码区域(3’-untranslated region,3’UTR)完全或不完全互补配对,对靶mRNA进行转录后调控,在细胞生长、发育、凋亡、肿瘤形成和病毒感染等多种生理病理过程中起重要作用。近年来,大量研究表明,在病毒感染宿主的过程中,miRNA可直接与病毒基因结合,调控病毒的感染复制与致病。与此同时,miRNA自身的表达具有病毒株特异性和一定的时向性。因此,miRNA在疾病的诊断、治疗方面均具有良好的应用前景。本课题主要研究两种病毒即甲型流感病毒H7N9和丙型肝炎病毒相关miRNA的特异表达,寻找传染性疾病的新型生物标志物,并分析其调控功能和作为生物标志物的诊断潜能。最终,拟在结合SPR技术的基础上建立多个miRNA的联合诊断平台,实现对相关传染性疾病的快速筛查。关于H7N9的致病机理与相关调控,目前还不是很清楚,基于甲型流感病毒血凝素(HA)在病毒感染致病中的重要功能,我们在动物和细胞水平对HA的致病性进行初步研究,并进一步在细胞水平观察了Let-7e的表达,分析其可能的调控作用。此外,根据miRNA可直接靶向病毒基因并调控病毒感染致病的原理,在特定组织中,以HA基因片段为例利用生物信息学预测调控流感病毒H7N9基因片段的人编码最佳miRNA,为实验室的基础研究提供较可靠的靶miRNA。除此之外,我们还筛查了有着大量感染人群的HCV感染者血清中miRNA的异常表达谱,并对miRNA作为HCV诊断标志物的潜能进行了评估,为进一步研究HCV感染过程中相关miRNA奠定基础。本研究分为以下三个章节：第一章H7N9编码HA蛋白诱导的病理反应及miRNA介导的稳态反应目的研究功能性蛋白HA对机体的病理作用,并进一步在细胞水平检测Let-7e的表达和分析Let-7e的调控功能。方法一方面,在动物水平研究HA蛋白诱导的病理作用。从广东省实验动物中心购买六周龄的Balb/C雌性小鼠,随机分为3组,分别是BSA、HA以及HA联合不完全佐剂组,每组6只。分别于0周、3周进行皮下接种,二次接种2周后,称量各组小鼠的体重,随后取胸腺及脾脏进行称重。此外,取未经处理的Balb/C雌性小鼠的脾脏,采用CCK8的方法进行体外淋巴细胞增殖实验,进一步了解HA诱导的免疫反应。另一方面,在细胞水平研究HA蛋白诱导的炎症反应,并进一步分析Let-7e的调控功能。选取单核细胞THP-1进行试验,THP-1是机体免疫防御反应的主要细胞之一,具有趋化吞噬的功能。首先,以终浓度100ng/ml的HA蛋白加入到接种于六孔板的THP-1细胞中,分别于作用Oh、2h、4h、8h、12h和24h后收集细胞及培养上清液；其次,以Ong/ml、10ng/ml、100ng/ml、200ng/ml不同浓度梯度HA刺激THP-1细胞4h后,同样收集细胞及培养上清液。此外,为进一步了解HA的促炎效应,联合HA (100ng/ml)与细菌内毒素LPS (1ng/ml)协同刺激THP-1细胞,分析炎症情况。最后,通过转染siRNA沉默TLR4的表达后,分析Toll样受体在HA诱导炎症反应中的作用。收集的RNA样本均保存于-70℃C,并利用实时定量PCR方法检测炎症因子包括ILla、IL1b、IL6和TNFa的表达,以及细胞和培养上清液中Let-7e的丰度。测定结果使用SPSS13.0软件进行相关的统计学分析。结果体内免疫HA可显著促进小鼠胸腺系数、脾脏系数,体外直接添加HA可显著促进原代培养的小鼠淋巴细胞增殖。此外,HA作用于THP-1细胞,分别在不同时间点和不同浓度梯度均可导致炎症因子IL1a和IL6表达显著上调,ILlb呈微弱上调趋势,而TNFa未见明显的变化；HA与LPS在一定程度上具有协同促进炎症因子ILla、ILlb和IL6的表达的作用。进一步研究HA的作用机理发现,在HA所致的炎症过程中,Let-7e在THP-1细胞内的表达显著上升而上清中的丰度显著下降；同时,沉默TLR4的表达,与NC对照组相比,炎症因子IL1a、IL6和TNFa的表达下调,而细胞内外Let-7e的表达逆转,炎症反应得到一定的缓解。结论HA可致小鼠机体产生明显的病理反应,促进机体的免疫反应。在THP-1细胞中,HA通过TLR4途径促进炎症反应的发生,Let-7e可能作为抑炎因子在HA诱导的免疫应激反应中起着重要的调控作用。第二章靶向流感病毒H7N9基因片段的人编码miRNA的生物信息学分析目的在特定组织细胞中利用生物信息学预测靶向流感病毒H7N9基因片段的人编码miRNA。方法根据miRNA直接靶向病毒RNA发挥功能的原理,基于H7N9基因片段的保守性,在特定组织细胞A549中对调控H7N9基因片段的人编码miRNA进行预测。首先,通过序列比对软件ClusterW2找出流感病毒H7N9基因片段(HA、NA、PB2、PA和PB1-F2)的保守区；然后,利用miRNA分析软件(FindTar3)预测靶向H7N9各基因片段的可能miRNA,并在此基础上筛选出靶点落在保守区的miRNA;最后,通过在线数据库(microRNA.org)分析其在肺组织细胞A549中的表达丰度,综合评估表达丰度及靶点自由能,预测调控流感病毒H7N9基因片段的最佳人编码miRNA。结果靶点分析得到种子区域匹配基因落在H7N9各基因片段保守区域的miRNA,分别是HA 51条、NA 37条、PB229条、PA 19条和PB1-F226条；经miRNA在肺组织细胞A549中的表达丰度分析,得到相对高表达、自由能小的miRNA,即可能调控流感病毒H7N9基因片段的最佳人编码miRNA,分别是hsa-miR-16调控HA和PB2片段、hsa-miR-21调控NA片段、hsa-miR-9调控PA片段和hsa-miR-193b调控PB1-F2片段。结论合理利用生物信息学在特定的组织细胞中预测靶向病毒基因片段的miRNA,可以为实验室的基础研究及临床治疗提供较可靠的靶miRNA,但结果需要进一步的实验验证。第三章HCV患者血清中miRNA异常表达谱的筛查及诊断潜能的评估目的利用miRNA芯片筛查HCV患者血清中miRNA的异常表达谱,验证芯片结果并评价其诊断潜能,为进一步研究HCV感染相关miRNA打下基础。方法收集并挑选2013年1月～2013年9月期间珠江医院未经治疗的HCV患者血清样本,保存于-70℃。以miRNA PCR芯片筛查高丰度HCV-RNA (HCV-RNA≥105 IU/ml)血清样本集合池中768个miRNA的表达,并在68例血清样本中,包括HCV-RNA阳性(HCV-RNA≥5×102 IU/ml)39例和正常对照29例,以miRNA PCR技术验证hsa-miR-122、hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629-5p的相对表达丰度,利用ROC曲线分析miRNA的诊断潜能。最后,通过miRNA预测软件及文献报道,对miRNA可能的作用靶点及功能进行了初步分析。结果miRNA PCR芯片筛查HCV患者血清中miRNA的异常表达谱,发现符合条件的miRNA106条,其中包括表达上调51条和下调55条；单个PCR验证结果显示,在HCV感染血清中hsa-miR-122、hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p和hsa-miR-629-5p的表达均上调(p<0.01); ROC曲线分析显示,hsa-miR-122具有较好的区分效能(AUC=0.950,95% CI:0.905～0.994), hsa-miR-629-5p的区分效能较差(AUC=0.704,95% CI:0.580～0.829),而hsa-miR-134、hsa-miR-424-3p具有中等的区分效能,相应的AUC分别为：0.803(95% CI：0.698～0.909)、0.840(95% CI：0.748-0.932)。此外,通过功能分析发现miRNA可在病毒的复制、炎症免疫反应和肿瘤形成等各个方面起着重要的调控作用。结论筛查HCV等传染性疾病患者血清中miRNA的异常表达谱,对疾病的诊断,以及致病机理的研究具有重要意义。小结1.HA可诱导小鼠机体产生明显的病理反应和促进局部的炎症反应,这在H7N9感染宿主过程中可能起着重要作用。2.HA可诱导Let-7e在THP-1细胞内表达丰度上升而细胞外的丰度下降,在一定程度上解释了H7N9患者血清中Let-7e表达下降的结果。3.Let-7e可能作为炎症抑制因子调控HA诱导的炎症应激反应,与H7N9的感染密切相关。4.在特定的组织细胞中利用生物信息学预测靶向病毒基因片段的miRNA,可以为实验室的基础研究及临床治疗提供较可靠的靶miRNA。5.HCV感染的血清中miRNA与正常对照相比发生改变,且具有一定的病毒株特异性,因此筛查miRNA的指纹谱对于HCV感染的诊断和治疗监测具有一定的临床应用价值。