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猪繁殖和呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),又称蓝耳病(Blue-ear disease),是由动脉炎病毒科的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种病毒性传染病,是一种以导致母猪发热、厌食、早产、流产、死胎等繁殖障碍及仔猪高死亡率和育成猪呼吸困难、发育迟缓为特征的疫病。该病自发现以来已给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。我国台湾于1991年发现有该病存在;1996年该病在北京及周边地区大规模暴发,随后该病不断蔓延到全国各地:尤其是自2006年以来,PRRSV出现变异株,造成我国约3000万头猪只死亡。本研究以冀南地区分布的各规模猪饲养场为研究对象,连续三年采取抽样和有针对性地进行PRRS的流行病学调查。然后进行病毒的灭活疫苗和病毒的分子进化及抗原性漂变研究。主要研究包括:1.为预防和控制猪繁殖与呼吸综合征,减少对养猪业带来的巨大经济损失,自2006年以来对冀南地区16个县市开展了PRRS的流行病学调查,确定该地区此病的发病情况、流行规律及防治措施:在此基础上,进行油乳剂灭活疫苗的制备与免疫效力研究。2.根据GenBank中ATCC VR-2332(U87392)的全基因序列,设计了8对特异性引物,应用一步法RT～PCR方法,通过反应条件和反应参数的优化,直接从病料中扩增出HPPRRSV基因组中的Nsp2、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7蛋白基因的cDNA片段,其大小分别为1200bp,1300bp,800bp,780bp,600bp,600bp,550bp和400bp。将上述8个基因片段重组到pUCm-T质粒载体中,得到重组质粒pUC-2.1,pUC-2.2,pUC-2,pUC-3,pUC-4,pUC-5,pUC-M,pUC-N。共获得66个GenBank登录号,序列同源性为94.3-100%。3.用MEGA、PHYLIP等软件进行分子进化研究,Nsp2及各结构蛋白的进化树结果均显示HPPRRSV与国内原有分离株的亲缘关系较近,尤其是与HB-1株的亲缘关系最近:所有HPPRRSV均分离自国内,推测HPPRRSV是由国内野毒株发生突变进化而来;在各进化树中HPPRRSV都可以分为三个大群,且江西分离株分布于HPPRRSV的各进化分枝上,从分子水平上证明HPPRRSV起源于江西。进化树中HPPRRSV与各疫苗株的亲缘关系均较远,解释了保护率低的原因。4.通过DNAman等软件推测氨基酸序列后比对,在前人已证明的36个抗原决定簇中HPPRRSV有30个发生了氨基酸突变,另有2个抗原决定簇缺失;用DNAstar软件的Protean程序进行各氨基酸序列的抗原性预测分析,与标准株ATCC VR-2332(U87392)及各疫苗株相比,HPPRRSV发生了很大的抗原性漂变现象。5.利用PAUP、PAML软件及Datamonkey的网上分析,采用HKY85模型进行SLAC(0.1＜p＜0.2),FEL(p=0.1)和REL(Bayes factory=50)方法分析,在Gp5蛋白上分析得到一个阳性突变位点,分析认为HPPRRSV突变在向宿主转移方向上积累。6.利用BamHⅠ,EcoRⅠ位点将N蛋白基因片段克隆到pET-28a载体,构建原核重组表达质粒pET-N,转化BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)(pET-N);重组菌经IPTG诱导后,N蛋白基因得到了高效表达;蛋白表达量可达菌体蛋白总量的52.635%,SDS-PAGE后切胶回收得到纯化的N蛋白,为进一步制备免疫胶体金试纸条或ELISA试剂盒提供基础。总之,本研究较为系统地解读了HPPRRSV河北流行株Nsp2及各结构蛋白基因的全序列进行生物信息学分析,弄清流行于河北地区猪群的PRRSV的来源、遗传学背景及进化方向,为进一步研究分子诊断方法、破译主要蛋白基因的功能、研制PRRS基因免疫疫苗和有效防疫PRRS提供了依据,为揭示PRRSV致病分子机制和PRRS新型疫苗奠定了基础。