Fostriecin (CI-920)是从链霉菌(Streptomyces pulveraceus ATCC31906)的发酵液中提取分离出来的结构新颖的天然磷酸酯类化合物,其抗肿瘤活性源于对DNA拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用以及选择性地抑制蛋白磷酸酶1(PP1)、蛋白磷酸酶2A (PP2A)和蛋白磷酸酶4(PP4)；体内实验证明,Fostriecin对小鼠淋巴白血病细胞P388和L1210均有很好的抑制作用,具有广谱抗肿瘤活性；因此,其作为先导化合物引起了很多科学家的兴趣并被作为抗肿瘤药物进行临床试验。目前,国外已经完成了对Fostriecin的Ⅰ期临床研究,结果较为理想；但是由于其在体内外的不稳定性,材料来源困难等因素导致临床研究未能进行下去。因此,目前迫切需要解决的问题是研究新的方法来生产Fostriecin以及新型衍生物,从而解决其纯度及稳定性问题。本课题的目标是对Fostriecin生物合成基因簇进行异源表达的研究,利用Red/ET同源重组技术试图在异源宿主菌中设计构建可以产生新型Fostriecin相关化合物的基因工程菌株,从而获得单一组分的化合物并为化学后修饰提供靶点。研究得到以下主要结论：(1)从链霉菌S. pulveraceus ATCC31906基因文库中获得了Fostriecin生物合成基因簇,并对Fostriecin生物合成相关的73kb的基因簇进行了生物信息学分析以及功能推测。基因簇中包含六个聚酮合酶基因(fosABCDEF),七个后修饰基因(fosGHIJKLM)以及八个与后修饰基因相关的基因(orfl-8)。(2)利用Red/ET同源重组技术构建了多个Fostriecin异源表达所需的基因克隆和表达载体。进行基因的一步融合构建了正负选择标记载体pRC,其可以在同源重组过程中实现阳性克隆的多次有效筛选,实现本研究中对多个较大基因片段的拼接；通过基因的精确替换构建了载体pMT和pCT,利用其中不同的筛选标记可以从含有不同抗性基因的载体中获得外源基因片段；另外,通过基因的定点插入构建了表达载体p184,其可与不同源复制子的表达载体共存,在同一宿主菌中对不同基因进行共表达。以上所构建的载体可以广泛应用于基因克隆操作中,为后续Fostriecin聚酮合酶基因簇的异源表达提供了克隆和表达的工具。(3)利用Red/ET同源重组技术将56kb的Fostriecin聚酮合酶基因簇(fosABCDEF)分段克隆到大肠杆菌共表达载体pMT和p184中,并将共表达载体转入可以促进聚酮合酶表达的工程宿主菌E.coli BG11-01和BAP1中,构建了Fostriecin聚酮合酶大肠杆菌异源表达系统BG11-01/p8-fosAB-pM-fosCDEF和BAP1/p8-fosAB-pM-fosCDEF,并进一步对表达系统进行诱导表达及其发酵产物的分析。虽然在发酵液中没有发现相关化合物产生,但是这一表达系统的建立为在异源宿主菌中设计构建可以产生新型Fostriecin化合物的基因工程菌株提供了可能,也为进一步分析Fostriecin聚酮合酶的功能以及生物合成代谢机制奠定了基础。(4)利用Red/ET同源重组技术将56kb的Fostriecin聚酮合酶基因簇(fosABCDEF)分段克隆到链霉菌整合型载体p126和游离型载体p124中,并将两个表达载体共同转入链霉菌模式表达菌株S. lividans TK24或者S. coelicolor M512中,构建了Fostriecin聚酮合酶链霉菌异源表达系统TK24/p6-fosAB～p4-fosCDEF和M512/p6-fosAB～p4-fosCDEF。对两个链霉菌表达系统进行发酵培养,发现其宿主菌中的色素基因均被激活,发酵液显示出不同的颜色；其RT-PCR结果也表明Fostriecin聚酮合酶基因簇在DNA水平得到了很好的表达。此外,仅在M512/p6-fosAB-p4-fosCDEF表达系统发酵液中获得了微量的Fostriecin前体化合物,进而推测出了一个Fostriecin生物合成代谢的新机制。(5)通过对Fostriecin生物合成过程中后修饰蛋白FosH的异源表达以及体外活性测试,发现其可以催化Dephosphofostriecin及衍生物完成C-9上的羟基磷酸化,证明了fosH为Fostriecin九位羟基的特异性磷酸激酶编码基因,完成了对其基因功能的定位。以上对Fostriecin生物合成相关基因簇异源表达的研究,为在异源宿主菌中设计构建产生新型化合物的基因工程菌株提供了可能,并为进一步分析Fostriecin聚酮合酶的功能以及Fostriecin生物代谢合成机制,及新型Fostriecin类似物的生物合成奠定了基础。