急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是造血细胞恶性克隆增殖性肿瘤,正常造血功能受损。其特点是治疗难度大病程发展迅速且预后差、易复发。精确的诊断和治疗需要细胞遗传学作为预测因子,基因的过表达和沉默提供必要信息。虽然现代化的治疗方案取得了一些进展,但疾病的复发率仍较高,初治的AML患者经过正规的化疗缓解率可达到80%,但仍有部分患者逃脱不了复发的命运,而复发的AML预后均较差。因此仍需对AML的发生发展机制及相关因素进行更深入的研究。SOCS1（Suppressor of cytokine signaling-1）基因是细胞因子信号转导抑制因子（Suppressor of cytokine signaling,SOCS）家族中的重要成员,是一类调节细胞信号传导通路的蛋白,它通过负反馈调节细胞信号的传导来发挥生物学功能。人SOCS1基因位于染色体的16p13.3,表达产物为含有221个氨基酸的蛋白质。近年多项研究发现SOCS1的启动子是位于该基因5’端功能区的CpG岛,它的异常甲基化会导致SOCS1表达沉默,表达沉默的SOCS1基因在致癌中发挥重要的作用,特别是在造血系统的恶性肿瘤和增殖性疾病中。SOCS1被公认为抑癌基因,在肝细胞癌中SOCS1基因甲基化发生率高达39%-60%,且与肝癌的淋巴转移和疾病进展相关。SOCS1的甲基化还发生于其它肿瘤性疾病,例如61%的子宫颈癌,45%的食管鳞状细胞癌,40%的肝母细胞癌等。随后,在胃肠道肿瘤、胰腺肿瘤等疾病都相继有SOCS1基因被高度甲基化的研究报道。最近的研究表明SOCS1可上调多发性骨髓瘤、乳腺癌和前列腺癌中微小RNA的表达以抑制肿瘤细胞的生长,进一步验证了SOCS1作为肿瘤抑制基因的作用。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMTs）的催化作用下,以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体,将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤双核苷酸（CpG岛或称CpG）的胞嘧啶上的过程。DNMTs主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,DNA甲基化需要被一个保守家族蛋白阅读,即甲基化CpG结合蛋白（methyl-CpG binding proteins）,它们通过甲基化DNA结合域（methylated DNA-binding domain,MBD）结合到5-甲基化胞嘧啶及紧跟其后的鸟嘌呤（5mCpG）上。目前已知有5种甲基化CpG结合蛋白,分别是MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3和MBD4。MeCP2和MBD2可以结合甲基化的DNA并且抑制靶基因的转录。STAT（signal transducers and activators of transcription）是信号转导与转录激活因子,JAK2（Janus kinase 2）可通过磷酸化而激活STAT,即JAK2/STAT（Janus kinase 2/signal transducers and activators of transcription）信号通路,导致靶基因的转录,最终促使细胞生长和增殖,其对肿瘤细胞的生长起到关键性的作用。首先,SOCS1的SH2区域结合磷酸化的酪氨酸后可阻断JAK2的激活和细胞信号的传导。其次,位于SH2区域上游的KIR区域可直接作用于JAK2激酶,抑制其活性使其不能与底物结合。第三,SOCS1 C-末端的SOCS-Box区域可组成E3泛素连接酶复合体启动包括JAK2在内的细胞因子信号转导蛋白的蛋白酶体降解。经过以上这三个途径SOCS1能抑制JAK2/STAT信号通路,从而负调控细胞因子的表达。但是在急性髓系白血病中SOCS1的表达水平、甲基化状态及内在机制上的研究国内外相关报道甚少,其有可能为急性髓系白血病的治疗提供新的靶点。本实验旨在明确SOCS1基因的甲基化致使其表达沉默与AML发生发展的关系。寻找治疗AML的新靶点。本研究分为三部分:第一部分急性髓系白血病患者SOCS1基因甲基化调控机制的研究目的:SOCS1是公认的抑癌基因,因其启动子甲基化而表达沉默在多种实体性肿瘤的发生发展中起了非常关键的作用。但是SOCS1基因甲基化与急性髓系白血病的关系目前尚无较深入的研究。本实验旨在明确SOCS1基因的甲基化致使其表达沉默与AML发生发展的关系。方法:将AML分为初治组50人,复发难治组10人,缓解组50人。设正常对照组10人。采用RT-qPCR的方法检测正常对照与AML患者骨髓单个核细胞中SOCS1的表达及DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2的表达,目的基因的mRNA相对表达水平以2^-△△Ct表示。采用MS-PCR方法检测SOCS1基因在AML初治组、复发难治组、缓解组中甲基化的差异。Western blot检测SOCS1蛋白的表达及下游JAK2/STAT信号通路各蛋白表达的变化,研究SOCS1的甲基化状态和表达水平在各组间的差异及其与甲基化相关基因、JAK2/STAT信号通路各蛋白之间的变化关系。同时对SOCS1基因甲基化状态与白血病预后相关突变基因FLT3-ITD、WT1/ABL和NPM1的表达以及与完全缓解所需治疗疗程进行了相关分析。结果:SOCS1基因的甲基化率在初治组和复发难治组中显著高于缓解组和正常对照组（P<0.05）。初治组和复发难治组中SOCS1 mRNA的相对表达量显著低于缓解组和正常对照组（P<0.05）,有统计学差异。DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a和甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2的mRNA表达在SOCS1甲基化组和复发难治组中表达显著高于非甲基化组和正常对照组（P<0.05）。AML初治组和复发难治组SOCS1蛋白相对表达量比缓解组和正常对照组显著减少（P<0.05）,而p-JAK2、p-STAT3和p-STAT5的蛋白表达在初治组和复发难治组中显著增高（P<0.05）,与SOCS1蛋白的表达呈负相关。t-JAK2、t-STAT3和t-STAT5的蛋白表达在四组中无明显差别。在SOCS1甲基化组WT1/ABL的阳性率显著高于非甲基化组,SOCS1甲基化组治疗一个疗程完全缓解率低于非甲基化组（P<0.05）。SOCS1甲基化与突变基因FLT3-ITD和NPM1的表达无相关性。小结:1.在AML中SOCS1基因的甲基化导致基因mRNA和蛋白的表达减少,随着AML的病情缓解SOCS1基因可转变为非甲基化状态,表达上调。2.DNMT1、DNMT3a和MBD2、MeCP2随着SOCS1的甲基化而表达增加,很可能参与了SOCS1基因甲基化的过程。3.SOCS1基因可通过抑制p-JAK2、p-STAT3和p-STAT5蛋白进而抑制了JAK2/STAT通路的信号传导以发挥生物学功能。4.SOCS1基因的甲基化与白血病的治疗转归和不良预后有相关性。第二部分去甲基化药物对U937和THP-1细胞株SOCS1基因的影响目的:基因的甲基化被认为是AML发病的关键环节,去甲基化治疗已被广泛应用于临床,尤其是为老年患者和不符合干细胞移植条件的患者带来了希望。在国内外针对SOCS1的基础研究中,旨在恢复或提高其表达的方法可作为抗癌疗法已被证实。那么,此部分实验是为了探讨在AML的治疗中,将SOCS1基因去甲基化是否也会有较好的抑制肿瘤细胞生长的效果。方法:体外培养白血病细胞株U937和THP-1,用去甲基化药物5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-azaC）和2’-脱氧-5-氮杂胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-dC）处理细胞株后,采用RT-qPCR的方法检测细胞株中SOCS1的表达水平及DNA甲基化转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、甲基化CpG结合蛋白MBD2、MeCP2的表达,采用MS-PCR方法检测SOCS1基因甲基化状态的改变。Western blot检测SOCS1蛋白的表达及下游JAK2/STAT信号通路各蛋白的变化。CCK-8法检测细胞生长率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:使用去甲基化药物5-azaC和5-aza-dC干预后,5-azaC对U937和THP-1细胞株的半数抑制浓度分别为0.95umol/L、17.05umol/L,5-aza-dC对U937和THP-1细胞株的半数抑制浓度分别为4.79umol/L、43.55umol/L。白血病细胞株U937和THP-1中SOCS1基因甲基化条带逐渐减弱,非甲基化条带逐渐增强。随着药物浓度的增加,SOCS1基因由完全甲基化状态逐渐转变为非甲基化状态,其mRNA和蛋白的表达逐渐增多,DNMT1、DNMT3a和MBD2、MeCP2的表达随之减少（P<0.05）,p-JAK2、p-STAT3和p-STAT5的蛋白表达显著减低（P<0.05）,t-JAK2、t-STAT3和t-STAT5的蛋白表达变化无明显差别。U937和THP-1细胞的生长率逐渐下降、凋亡率逐渐上升。小结:1.去甲基化处理后,可逆转白血病细胞株中SOCS1基因为非甲基化状态,相应表达开始增加。SOCS1的表达水平与去甲基化药物成浓度依赖性2.DNMT1、DNMT3a和MBD2、MeCP2参与了SOCS1的甲基化过程。3.增多的SOCS1基因通过抑制p-JAK2、p-STAT3和p-STAT5的表达抑制JAK2/STAT信号通路的活性。随着SOCS1的表达上调,AML细胞的生长受到抑制。第三部分SOCS1基因转染U937和THP-1细胞株的机制研究目的:SOCS1基因的甲基化、突变或缺失能引起肿瘤,并增加肿瘤的侵袭性和转移,前面的实验提示我们减少SOCS1的甲基化或恢复SOCS1的表达能够抑制JAK2/STAT信号通路从而抑制白血病细胞的生长、促进白血病细胞的凋亡。此部分实验的目的是为了证明SCOS1基因确实可以直接下调JAK2/STAT信号通路的活性,抑制AML细胞的生长,进一步完善本实验。方法:运用转染技术,将带有SOCS1基因的质粒转染入白血病细胞株U937和THP-1中,Western blot检测在SOCS1基因表达增多的白血病细胞株中JAK2/STAT通路各蛋白水平的改变。CCK-8法检测细胞生长率,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:将带有SOCS1基因的质粒成功转染入U937和THP-1细胞株内,SOCS1基因蛋白的相对表达明显高于转染前（P<0.05）;p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5蛋白表达随着SOCS1基因的增多均减少（P<0.05）,但t-JAK2、t-STAT3、t-STAT5蛋白表达没有明显变化。随着SOCS1基因的表达增多,两种白血病细胞株的生长率逐渐降低,凋亡率逐渐升高。小结:1.AML细胞株转染SOCS1基因后,可有效抑制细胞的生长,促进凋亡。2.SOCS1作为抑癌基因负向调控JAK2/STAT信号通路。