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目的:位于C9orf72基因非编码区的六碱基GGGGCC重复突变可以导致Amyotrophic lateral sclerosis(ALS)及Frontotemporal dementia(FTD),其致病机制尚不明确。GGGGCC重复可以通过非ATG依赖翻译多种多聚形式的重复蛋白,但是这些重复蛋白是否具有细胞毒性尚未知晓。本论文在不同细胞中研究这些重复蛋白是否具有毒性,并且探索其在ALS和FTD致病机制中的作用。方法:本论文构建含有30个GGGGCC重复序列,并且能够按照不同读码框分别表达多聚甘氨酸-丙氨酸(poly-GA),多聚甘氨酸-脯氨酸(poly-GP),多聚甘氨酸-精氨酸(poly-GR)的N端带有FLAG标签的质粒。同样的方法构建了GFP标签位于N端的多聚甘氨酸-丙氨酸(poly-GA),多聚甘氨酸-脯氨酸(poly-GP),多聚甘氨酸-精氨酸(poly-GR),多聚脯氨酸-精氨酸(poly-PR)以及多聚脯氨酸-丙氨酸(poly-PA)的质粒。为了排除这些质粒中GGGGCC重复RNA毒性的影响,通过合成30个GGAAGA重复序列和30个GGAGCA重复序列,利用密码子的简并性,分别构建带有FLAG标签和GFP标签的多聚甘氨酸-精氨酸(poly-GR)和多聚甘氨酸-丙氨酸(poly-GA)质粒。接着,在HEK293细胞中转染这些质粒,通过PI染料免疫荧光观察,MTT方法检测这些重复蛋白对细胞的毒性作用。同时为了观察这些重复蛋白对神经细胞的毒性,在NSC-34以及SH-SY5Y细胞中过表达这些质粒并用同样的方法进行检测。本论文用泛素蛋白酶体抑制剂MG132以及自噬抑制剂Bafilomycin A1处理转染后的细胞,以观察这些蛋白对泛素蛋白酶体(UPS)和自噬途径的影响。为探索含精氨酸重复蛋白对核仁功能的影响,利用荧光定量PCR检测转染后细胞中的核糖体RNA的含量。在HEK293细胞中长时程表达重复蛋白后和核仁应激诱导药物Act D处理的细胞相对比,以确认核仁应激现象的产生。利用蛋白质质谱分析技术,分析重复蛋白与哪些蛋白相互作用,同时利用免疫共沉淀的方法进一步确定与哪些蛋白相结合。本论文还利用免疫荧光方法在HEK293细胞中观察这些重复蛋白对应激颗粒形成的影响。结果:在本论文所采取的细胞模型中,这五种重复蛋白并不容易产生聚集,而且不受泛素蛋白酶体和自噬调控。此外,仅仅只有poly-GR和poly-PR定位于核仁,引起关键的核蛋白B23(nucleophosmin)从核仁转运至核质,导致核仁应激并引起细胞死亡。这两种异常翻译的重复蛋白——poly-GR和poly-PR介导的核功能缺陷还可抑制核糖体RNA生成,造成应激颗粒形成受损。结论:本论文通过研究提出了一个简单的分子致病机制模型:在携带C9orf72突变的ALS/FTD病人体内,其不依赖于ATG而异常翻译的重复蛋白产生的毒性并非是重复蛋白聚集引起而是核仁应激引起的,核仁应激是C9orf72致病的首要因素。