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传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性禽类传染病,给养鸡业带来了重大的经济损失。自20世纪30年代,Massachusetts型IBV被分离鉴定以来,世界各地陆续分离得到了不同血清型的IBV,且各个血清型间交叉反应小,甚至没有明显的交叉反应,给IB的防制带来了巨大的困难。目前,LX4型IBV毒株已在世界多个国家广泛流行,对养禽业造成了巨大的损失。我国目前广泛应用的Mass型疫苗不能对LX4型IBV提供有效的保护,免疫鸡群体感染LX4型病毒后,体内仍能分离到LX4型IBV。因此,开发出更为安全高效的新型IBV疫苗已成为当务之急。为了研发针对LX4型IBV的新型疫苗,本研究以新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota疫苗株为载体,通过反向遗传技术,构建获得了表达LX4型IBV流行株ck/CH/LDL/091022 S1蛋白的重组病毒,命名为rLaSota-S1。生长动力学结果显示,r LaSota-S1与亲本病毒LaSota在鸡胚中生长模式相似,表明IBV S1的插入不明显影响载体病毒的复制。经测定,r LaSota-S1的最小致死量致死鸡胚的平均时间(Mean death time,MDT)为165.3h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(Intracerebral pathogenicity index,ICPI)为0,而LaSota的MDT为100h,ICPI为0.19,这表明IBV S1的插入进一步致弱了LaSota的毒力。间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)以及Western Blot证实S1蛋白能够在r LaSota-S1感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)中稳定表达并包装至病毒粒子中。为了评价rLaSota-S1的免疫保护效力,用rLaSota-S1和LaSota免疫SPF鸡,每周采血分离血清。HI试验结果表明rLaSota-S1与LaSota均能诱导机体产生针对NDV的HI抗体。ELISA试验结果证明rLaSota-S1能够诱导机体产生针对IBV的特异性抗体。免疫后21天分别用ck/CH/LHLJ/1/06型NDV和ck/CH/LDL/091022型IBV强毒株进行攻击。结果显示rLaSota-S1和LaSota免疫组用NDV攻击后没有出现任何临床症状,存活率为100%,对照组鸡在攻毒后第四天全部死亡。攻毒后第4天rLaSota-S1和LaSota免疫组呼吸道排毒率均为10%,攻毒后第8天后没有检测到排毒。rLaSota-S1免疫组及对照组用IBV强毒攻击后,定期采集喉头拭子,通过real-time RT-PCR检测拭子中的IBV RNA,r LaSota-S1免疫组的呼吸道排毒率分别为80%、50%、33.3%和16.7%。而对照组的呼吸道排毒率分别为100%、66.7%、66.7%和33.3%。结果表明,和对照相比,免疫组呼吸道排毒率显著降低。rLaSota-S1免疫组死亡率为40%,而对照组的死亡率高达70%。由于一次免疫效果并不理想,所以本试验对免疫程序进行了调整,在首次免疫2周后以相同剂量加强免疫,并每周对鸡进行采血,通过流式细胞仪对外周血T淋巴细胞亚群比例进行分析,结果表明,免疫鸡只的CD3+CD4+T淋巴细胞、CD3+CD8+T淋巴细胞比例显著高于对照组,并且在加强免疫后显著升高,说明r LaSota-S1能够诱导机体产生细胞免疫反应。ELISA试验结果显示,加强免疫后IBV抗体水平显著升高。加强免疫一周后用IBV强毒进行攻击,攻毒后定期采集攻毒鸡的喉头拭子,通过real-time RT-PCR检测拭子中的病毒载量,结果显示,加强免疫后,鸡只呼吸道排毒率分别为66.7%、35.7%、14.3%和7.1%,远低于对照组。攻毒后第5天对鸡进行捕杀,采集组织样品,通过real-time RT-PCR检测组织中的病毒载量,结果表明,加强免疫后,组织中病毒载量明显低于对照组。上述结果表明,rLa Sota-S1加强免疫后,对IBV强毒株的攻击产生的保护效果相比一次免疫组显著提高,临床保护率可达到93.3%。