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目的尿路结石为临床常见病、多发病,积极寻求一种安全且疗效确切的防治结石新疗法,一直是医学界关注的问题。排石冲剂治疗尿路结石有三十多年的历史,临床研究表明具有抗炎效果,有效率达86%。草酸钙(CaOx)是尿路结石的主要成分,CaOx晶体诱导肾上皮细胞氧化应激(OS)和炎症损伤是尿路结石形成的关键,本研究以CaOx结石大鼠及离体NRK52E细胞为模型,观察草酸(Ox)、CaOx晶体诱导肾上皮细胞氧化应激、炎症损伤过程及对细胞间紧密连接(TJ)结构和功能的影响,并以排石冲剂进行干预,探讨排石冲剂防治尿路结石并能防止其复发的分子机制和作用靶点,为该方能更广泛应用于临床提供理论依据。方法1动物实验采用以乙二醇和氯化铵为成石剂,建立CaOx结石大鼠模型。将雄性8-9周龄SPF级Wistar大鼠48只,适用性喂养1周后,随机分为四组:空白对照组12只,给予生理盐水灌胃,2ml/d;模型对照组12只,给予成石剂;排石冲剂治疗组12只,给予成石剂及排石冲剂配成1.2 g/ml的混悬液灌胃,2ml/d;枸橼酸钾治疗组12只,给予成石剂及25%枸橼酸钾溶液灌胃,2ml/d。实验周期为28d。收集大鼠24h尿液,由腹主动脉血管采集血标本,采用生化分析仪测定血清中BUN、Cr、Ca2+、Mg2+、P3+含量;取左肾置于4%多聚甲醛溶液中固定,后经石蜡包埋,作常规切片,行HE染色和Von Kossa’s染色,并采用免疫组化法检测大鼠肾组织中TGF-β1、NF-κB、KIM-1、MCP-1、IL-6、OPN、AngII、AT1R、AT2R、ACE、ACE2及occludin、ZO-1蛋白的表达情况。右肾置于液氮中,经组织匀浆,分别做以下检测:①对肾组织中SOD活性和MDA含量进行检测;②提取总RNA,采用RT-PCR法检测大鼠肾组织中TGF-β1、NF-κB、KIM-1、MCP-1、IL-6、OPN、AngII、at1r、at2r、ace、ace2和occludin、zo-1的mrna水平;③提取总蛋白,采用westernblotting技术检测大鼠occludin、zo-1蛋白的表达量。2体外细胞实验将大鼠肾小管上皮(nrk52e)细胞经复苏、传代后,分为5组:空白对照组仍以5mldmem液进行培养;ox、一水草酸钙(com)损伤组换上含1.0mmol/lox+500μg/mlcom的5mldmem液进行培养;治疗对照组分别换上含1.0mmol/lox+500μg/mlcom及高、中、低浓度含药血清(含10%)的5mldmem液进行培养。48h后移去上述培养液,取各组nrk52e细胞,以ph7.4的中性pbs液再冲洗2次,分别提取总蛋白质及总rna,采用westernblotting技术及rt-pcr方法检测occludin、zo-1蛋白和mrna水平的表达。结果1大鼠一般情况:实验过程中,各组大鼠均未死亡,模型对照组大鼠于实验第四周出现食欲减退,毛发不荣,饮水减少,尿量减少,精神倦怠,身体蜷缩,且体重降低,尿量减少;而排石冲剂干预后,大鼠的体重和尿量均增加,精神状况良好,饮食活动基本正常。2大鼠血尿生化情况:与空白对照组比较,模型对照组大鼠尿中ox、ca2+、p3+排泄量增加,mg2+排泄量减少;血中bun、cr、ca2+、p3+含量增加,mg2+含量减少。而排石冲剂干预后,大鼠尿中ox、ca2+、p3+排泄量减少,mg2+排泄量增加;血中bun、cr、ca2+、p3+含量减少,mg2+含量增加。结果表明:ox、caox晶体能导致大鼠尿中ox、ca2+、p3+等水平增加,结石形成抑制物mg2+水平降低,促进结石的形成;排石冲剂的干预作用可能通过降低尿中ox、ca2+、p3+等的含量,升高mg2+含量,从而抑制结石的形成。3大鼠肾脏病理改变情况:与空白对照组比较,模型对照组大鼠肾组织色泽暗淡,明显肿胀,有突出并散在分布的颗粒物,切面中心发白,且有大量的结晶形成,肾小管管腔扩张明显;而排石冲剂干预后,大鼠肾脏表面颜色正常,切面中心颜色稍淡,且肾脏中结晶量较少,零星散在分布,少数肾小管有不同程度的扩张。结果表明:ox、caox晶体能使大鼠肾脏发生病理改变;排石冲剂可能通过干预病理改变过程,达到保护肾脏、防治结石的目的。4大鼠肾组织中氧化应激及炎症损伤情况:与空白对照组比较,模型对照组大鼠肾组织中,sod活力降低,mda含量增加,tgf-β1、nf-κb、kim-1、mcp-1、il-6和opnmrna和蛋白的表达明显增多;而排石冲剂干预后,大鼠肾组织中sod活力升高,mda含量降低,tgf-β1、nf-κb、kim-1等指标的表达均降低。结果表明:ox和caox晶体能降低sod活力,升高mda含量,上调tgf-β1,增加ros产生,上调nf-κb、mcp-1、il-6等的表达,促进肾上皮细胞的os和炎症损伤,增加opn表达,促进晶体粘附、核化和聚集;排石冲剂的干预作用可能通过升高sod活力,降低mda含量,直接或间接下调tgf-β1,减少ros产生,下调nf-κb、mcp-1、il-6等的表达,以减轻肾上皮细胞的os和炎症损伤,调节肾组织中opn蛋白表达水平,干预caox晶体的粘附、核化和聚集,从而达到抑制结晶的沉积,保护肾小管上皮细胞的作用。5大鼠肾组织中ras相关指标的表达情况:与空白对照组比较,模型对照组大鼠肾组织中,angii、at1r、acemrna和蛋白表达明显增加,at2r和ace2mrna和蛋白表达降低;而排石冲剂干预后,在大鼠肾组织中angii、at1r、ace的表达有所增多,at2r和ace2的表达有所降低。结果表明:ox、caox晶体能激活了大鼠肾脏局部的ras,通过ace表达增加可将angi转化angii,大量的angii与at1r结合发挥其促进os和炎症损伤的作用,同时,angii还能介导opn的表达以促进晶体成核和聚集;排石冲剂对caox结石干预作用可能是通过上调ace2,将angⅠ转化为ang-(1-9),也可将angii降解成ang-(1-7),从而使肾脏中angii水平下调,并能通过上调at2r的表达,拮抗at1r介导的angii效应,以减轻肾上皮细胞的os和炎症损伤,从而达到保护肾脏的目的。6体内外大鼠肾小管上皮细胞中tj相关指标表达情况:①动物实验:与空白对照组比较,模型对照组大鼠肾组织中occludin、ZO-1的表达明显减少;而排石冲剂干预后,在大鼠肾组织中的表达增多。②体外细胞实验:与空白对照组比较,模型对照组中的occludin、ZO-1的表达明显减少;而排石冲剂干预后,occludin、ZO-1的表达增多,且随着药物血清浓度的增加,表达增多。结果表明:Ox和CaOx晶体可以直接或间接地(通过OS和炎症损伤)作用于对大鼠肾小管上皮细胞,破坏细胞间的TJ的结构,从而导致肾小管内结晶、钙及草酸、磷酸等离子向肾上皮细胞间迁移,启动肾小管间质的炎症损伤和Randall′s斑块的形成,这可能是结石形成和生长的一个基础;排石冲剂对Ox和CaOx晶体诱导的大鼠肾小管上皮细胞TJ蛋白改变具有恢复作用,这种作用可能通过抑制相关细胞因子的表达发挥作用,也可能直接作用于肾小管上皮细胞,以促进细胞损伤恢复及减少结晶的黏附,干预结石的形成。结论1采用乙二醇和氯化铵法复制CaOx结石大鼠模型成功。2 Ox、CaOx晶体能通过诱导相关细胞因子的表达,导致肾小管上皮细胞的OS和炎症损伤,促进晶体粘附、核化和聚集;排石冲剂可能通过干预这个过程达到防治结石、保护肾脏的目的。3 Ox、CaOx晶体能激活大鼠肾脏局部的RAS,以促进OS、炎症损伤及晶体成核和聚集;排石冲剂可能具有拮抗相关效应分子的表达,以减轻OS和炎症损伤,达到防治结石、保护肾脏的目的。4 Ox、CaOx晶体能破坏了体内外肾小管上皮细胞TJ的结构,以促进细胞损伤及结石形成;排石冲剂可能通过恢复TJ相关蛋白的表达,以减轻细胞损伤、抑制晶体黏附,达到干预结石形成、保护肾脏的目的。