论文部分内容阅读
紫草宁及其衍生物是萘醌类天然色素,在紫草科植物如硬紫草、滇紫草和新疆紫草的根部合成积累,具有抗菌、消炎、抗肿瘤等活性。近年来,萘醌色素已被广泛用作天然的染料以替代人工化学合成的染料,并已被越来越多地用在食品、医药和化妆品行业。目前已建立了紫草细胞的两阶段培养体系,第一阶段是细胞在B5固体培养基体系中进行生长繁殖这一阶段细胞不产生紫草宁；第二阶段是把在B5培养基中生长的紫草细胞转接到M9液体培养基黑暗中振荡培养时,紫草宁即被快速诱导合成。这种独特的两阶段培养体系为研究次生代谢产物合成的触发机制提供了一个优良的研究系统。深入研究这种“触发”效应的分子机理,可为紫草次生代谢的生物工程实践奠定理论基础。紫草宁及其衍生物是由苯丙素类(phenylpropanoid)的代谢产物对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid, PHB)和甲戊二羟酸(mevalonate acid, MVA)代谢途径形成的焦磷酸香叶酯(geranylpyrophosphate, GPP)这两个重要前体经对羟基苯甲酸香叶基转移酶(p-hydroxybenzoate:geranyltransferase, PGT)催化形成香叶基-对羟基苯甲酸(m-geranyl-p-hydroxybenzoic acid, GBA),再经一系列反应最后在内质网中形成的,并通过胞外分泌作用将形成的紫草宁微粒运输到原生质体外的细胞壁中。尽管紫草宁的生物合成代谢途径现已基本清晰,代谢途径中的许多酶基因得以分离和克隆,然而,紫草宁合成的分子调控机制还知之甚少。MYB、MYC类转录因子是调节苯丙素代谢的重要的调控因子,其中R2R3型MYB含有DNA结合结构域两个R重复结构域,每个结构域大约有50个氨基酸残基。MYC转录因子在C-端含有保守的bHLH结构域。MYB、MYC在调节苯丙素合成方面(如花青素、鞣质、黄酮和木质素)具有重要的功能。鉴于紫草宁的生物合成同样具有苯丙素的共同代谢途径,我们认为MYB、MYC可能在调节紫草宁的生物合成代谢方面同样具有重要的功能。我们从硬紫草细胞中分离克隆了3个R2R3型MYB基因,分别命名为LeMYB1、LeMYB2和LeMYB3,其编码蛋白均具有两个典型R的DNA结合结构域,分子量分别为24.55、35.60和30.40KD,等电点为pI为9.32、8.64和8.56。系统进化树分析表明,LeMYB1属于R2R3类MYB第二亚家族,与茉莉酸诱导的苯丙素代谢调控有关,LeMYB2和LeMYB3属于第四亚家族属于抑制性的转录调控因子,可能参与紫草宁代谢精细调控。我们从硬紫草细胞中分离克隆了1个MYC基因,命名为LeMYC,其编码蛋白具有bHLH结构域,分子量为69.80KD,等电点pI为5.78。系统进化树分析表明LeMYC属于Ⅲ(d+e)亚家族,与茉莉酸诱导的次生代谢调控相关。另外,我们还分离克隆了LeMYB1、LeMYB2和LeMYC基因的启动子序列。PLACE预测分析结果表明,这些序列不仅含有TATA box和CAAT box等保守的启动子元件和转录起始位点INR,还有与植物生长发育相关元件和植物激素调节元件,并存在大量潜在植物逆境应答元件,如W-box、BIHD10S、GT-1 motif等。值得注意的是,在这两基因的启动子序列中存在紫草宁合成调控因子相关元件,如Cu2+应答元件和MeJA响应元件,暗示LeMYB1和LeMYB2基因受Cu2+和MeJA调控。我们运用real-time PCR技术研究了MYB、MYC基因的表达。结果表明,MYB、MYC基因在细胞从B5培养基转接到M9培养基后的短时间内被快速诱导增强表达；这些基因受茉莉酸诱导增强表达,而JA合成的抑制剂IBU则抑制其表达；2,4-D抑制MYB表达,但对MYC基因的表达没有影响；组织特异性表达分析结果表明,MYB、MYC基因主要是在紫草的根部高度表达。为了初步探讨基因的功能,我们将已克隆的LeMYB1转入拟南芥中获得转LeMYB1的拟南芥,对T1代转基因的拟南芥的表型分析发现,转LeMYB1的拟南芥叶色发紫,茎颜色加深,表现出明显的植株花青素含量的提高。另外,我们建立了一种简单快速诱导硬紫草毛状根产生的方法,即“针刺幼茎法”。用发根农杆菌15834针刺侵染硬紫草幼苗茎节可快速诱导毛状根的产生。毛状根除菌培养后转接到无激素的固体B5培养基或RC等无铵离子的液体培养基上,发现毛状根迅速大量繁殖分支多,生长旺盛。PCR检测表明rolC基因已经整合到硬紫草基因组中。将生长旺盛的毛状根培养在M9或RC液体培养基上,毛状根可产生大量紫草素。基于建立的此转基因体系,我们获得了LeMYB1的转基因紫草毛状根。色素测定初步结果表明,转LeMYB1毛状根的紫草宁含量明显高于无外源基因的毛状根,这一结果暗示LeMYB1在促进紫草宁的生物合成方面可能发挥着重要作用。后续的研究将从多个角度深入揭示MYB促进紫草宁合成的分子机理。本研究首次通过“针刺幼茎法”获得了硬紫草毛状根株系,为大规模培养、生产紫草素奠定了基础。本研究不仅深化了我们对次生代谢合成调控分子机制的认识,而且为高效调控次生代谢的生物工程实践奠定了理论基础。