目的:结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一,且在结直肠癌患者的疾病进展过程中约有35%~55%的患者会出现肝肺等远处转移,这些患者生存率明显下降。结直肠癌I期患者的5年生存率高达80-90%,而在晚期结直肠癌患者中则低于10%。手术一直是而且目前仍然是结直肠肿瘤的主要治疗方法,而新辅助放化疗及辅助化疗则是预防术后复发和提高生存率的重要手段。结直肠癌是一种遗传异质性疾病,目前除了对少数几个基因(APC,p53,KRAS)的研究机制较明确外,参与了CRC(colorectal cance,结直肠癌)发病过程的其他大部分基因暂不明确。因此,人们一直在尝试发现新的CRC易感性基因,以用于常规遗传学诊断及临床治疗。SPERT基因(spermatid associated)定位于人染色体13q14.13,是一种蛋白质编码基因,该基因编码产物为SPERT蛋白,属于Chibby蛋白质家族。SPERT蛋白的功能尚不清楚,其在哺乳动物的进化中高度保守,具有它独特的属性,其结构中含有一个亮氨酸拉链结构(leucine zipper,LZIP)和两个卷曲螺旋区域(coiled-coil,CC),在许多情况下亮氨酸拉链结构参与同源二聚化或寡聚化,它们往往是和癌基因表达调控功能有关,故受到研究者的重视。本课题首先利用生物信息学方法分析了SPERT表达水平与结直肠癌临床资料的相关性,并通过人结直肠癌肿瘤细胞系体外培养干预实验和裸鼠成瘤动物模型实验,采用RNA干扰技术、实时荧光定量PCR、慢病毒载体转染、Western Blot、Celigo细胞计数法、MTT法、流式细胞术、Path Scan信号通路检测、IHC免疫组化、TUNEL法等手段,从分子、细胞以及动物整体水平探讨SPERT这个功能未知的基因对结直肠肿瘤细胞的生物学特性的影响及其可能的作用机制,并进一步从动物模型验证。具体研究内容分为三个部分:(1)基于生物信息学方法筛选出目的基因SPERT,并分析其在结直肠癌中的表达情况及其与临床资料的相关性;(2)探讨RNA干扰技术沉默基因SPERT对大肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用的可能机制;(3)探讨SPERT基因沉默对大肠癌细胞在动物体内成瘤的影响。本课题初步探索SPERT在结直肠癌的发生、发展中的潜在作用,并揭示其潜在的发生机制,为临床有效诊治结直肠癌提供新思路、新靶点。方法:第一部分:利用大规模多组学数据,通过TCGA(The Cancer Genome Atlas,癌症和肿瘤基因图谱)数据库中结肠癌(Colon adenocarcinoma,COAD)和直肠癌(Rectum adenocarcinoma,READ)两大类数据,选取RNAseq以及RNAseq V2的成对样本数据进行分析,筛选出差异表达有统计学意义的目的基因,在获取与结直肠癌疾病相关的生物分子信息(即目的基因)后,再进一步利用生物信息学方法分析其在癌组织中的表达水平与大肠癌患者的淋巴结转移、远处转移以及病理分期等临床资料的相关性,并进行统计学分析。第二部分:以目的基因SPERT为模板,设计RNAi靶点序列,构建RNAi慢病毒载体,并转染大肠癌肿瘤细胞。本部分实验中使用q PCR(Quantitate Real-Time PCR,实时荧光定量PCR)的方法检测目的基因在不同结直肠癌细胞中m RNA的表达丰度,采用2-ΔΔCt分析法计算,选用结直肠癌细胞系中目的基因SPERT表达量最突出的细胞系作为实验目的细胞。在慢病毒成功感染目的细胞后,分别应用q PCR的方法检测细胞中目的基因敲减后m RNA的表达量,以及WB(Western Blot,蛋白免疫印迹)的方法检测细胞中目的基因敲减后蛋白的表达量,进而判断靶点的干扰效果。接着,采用Celigo细胞计数法检测记录各时间点的细胞数目,从而分析细胞的生长状况;通过MTT法检测细胞活力来验证目的基因对细胞增殖的影响;Caspase-Glo?3/7 Assay法检测细胞凋亡情况来验证目的基因对细胞凋亡的影响;FACS(Fluorescence Activating Cell Sorter,流式细胞仪)(Annexin V-APC单染法)检测处于凋亡状态的细胞数量来检验目的基因与细胞凋亡的关联,了解该基因沉默后对结直肠肿瘤细胞的增殖、凋亡的影响。第三部分:根据上述的实验结果确定SPERT的功能后,使用Path Scan?Antibody Array Kit检测和比较sh Ctrl对照组与sh SPERT干预组细胞中应激和凋亡信号通路关键信号分子的变化,包括P44/42 MAPK(ERK1/2),Akt,Bad,HSP27,Smad2、p53、p38 MAPK、SAPK/JNK、PARP、Caspase-3、Caspase-7、IκBα、Chk1、Chk2、e IF2α、TAK1、Survivin;初步筛选关键信号分子后,再通过Western Blot蛋白免疫印迹法对相关信号通路中关键信号分子进行检测、验证,初步确定目的基因SPERT的下游作用分子及其可能的信号传导通路,寻找其可能的作用途径。第四部分:在上述工作的基础上,饲养BALB/c裸小鼠做体内成瘤模型实验,用慢病毒感染成功的细胞行皮下注射(右侧腋皮下),本实验分为2组,每组10只。观察目的基因SPERT沉默对肿瘤生长的影响,观察各组小鼠肿瘤体积、重量的变化;取各干预组和对照组裸鼠的肿瘤组织做病理检查,免疫组织化学法IHC检测Ki-67阳性表达指数,TUNEL法检测细胞凋亡指数,并进行相关性分析;动物模型实验进一步验证SPERT的功能。结果:第一部分:(1)经过对成对样本的统计分析及最终筛选,得到最终确定用来分析的目的基因SPERT,此基因在TCGA数据库共享的大量样本中癌组织的m RNA表达丰度显著高于癌旁组织(log FC>1即FC>2,且P-value<0.05)。(2)患者癌组织中SPERT基因的表达水平在大肠癌的区域淋巴结转移、远处转移和病理分级不同分组中有显著差异(P<0.001),提示SPERT的表达与上述临床病理指标有密切相关,可以作为大肠癌患者病理分期临床诊断的指标。第二部分:(1)以SPERT基因为模板,设计RNA干扰靶点序列(ACAAGATCCTACAGGTCTT),成功构建目的基因RNA干扰慢病毒载体(载体构建序列如下:h U6-sh RNA-CMV-EGFP),且所构建的慢病毒载体经PCR鉴定和测序分析无误。(2)q PCR方法检测SPERT基因在三组结直肠癌细胞株RKO、SW480、HCT 116中的m RNA表达丰度分别为14.59±0.131,16.33±0.165,16.92±0.142;从结果可以看出,SPERT基因在RKO细胞中表达丰度为中,在SW480、HCT 116细胞中表达丰度都为低;显示SPERT基因在RKO细胞中表达量最突出,确定用RKO细胞来进行SPERT基因沉默实验最具意义。(3)转染的感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10,感染目的细胞后72小时于显微镜下荧光观察,细胞转染效率超过80%,细胞状态良好,表明慢病毒感染效果好。q PCR验证结果显示SPERT的m RNA表达量在sh SPERT组为0.097±0.021,阴性对照sh Ctrl组为1.008±0.148,干预组RKO细胞中SPERT基因在m RNA水平的表达量明显受到抑制;Western Blot结果也显示,靶点对目的基因的外源表达有敲减作用,差异有统计学意义(P<0.01),因而是有效靶点。(4)Celigo细胞计数检测细胞生长结果显示,与对照组(sh Ctrl/NC组)相比,sh SPERT干预组各时段细胞数量均下降,细胞的增殖速率受到显著抑制,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT法检测细胞增殖活性结果也显示,相比sh Ctrl对照组,sh SPERT干预组细胞的活力受到明显抑制,生长减缓,差异有统计学意义(P<0.01);提示SPERT基因与RKO细胞的增殖能力显著相关,敲减SPERT基因对细胞增殖有减缓作用。(5)Caspase-Glo?3/7 Assay法检测细胞凋亡结果显示,相对于sh Ctrl对照组细胞(46890±628.615),sh SPERT组细胞Caspase3/7活性增加(105831±838.816),凋亡细胞增多,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术(Annexin V-APC单染法)检测细胞的凋亡结果也显示:sh Ctrl组与sh SPERT组细胞凋亡率分别为(5.93±0.06)%与(20.65±0.26)%,相比sh Ctrl对照组,sh SPERT组细胞凋亡数增多,差异有统计学意义(P<0.05);提示SPERT沉默可以促进RKO细胞的凋亡。第三部分:(1)Path Scan初筛检测结果提示,SPERT沉默可以影响Stress and Apoptosis信号通路中相关关键信号分子的表达,其通路中P44/42 MAPK(ERK1/2),Akt,Bad,HSP27,p38 MAPK和Chk2蛋白磷酸化水平上调(P<0.05);PARP和Caspase-3蛋白表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.05),提示SPERT基因沉默抑制人结肠癌细胞RKO的增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用可能与这些位点相关。(2)这些因子在细胞的存活、增殖和凋亡方面具有重要作用,而它们也基本富集在p38MAPK/HSP27信号通路中,Western Blot结果也显示p38 MAPK和HSP27蛋白磷酸化水平上调,PARP和Caspase-3蛋白表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05);提示SPERT基因可能通过调控p38MAPK/HSP27信号通路来影响人RKO细胞的增殖和凋亡。第四部分:(1)在动物体内实验中,我们成功的构建了裸鼠成瘤模型,两组实验裸小鼠的皮下肿瘤呈结节状不规则形,无包膜,边界不清。对照组(NC组)裸小鼠形成的肿瘤体积明显大于干预组(KD组)的瘤体体积,对照组的肿瘤体积为1101.93±541.79 mm3,干预组的肿瘤体积为155.45±151.63 mm3,两组数据对比有统计学差异(P<0.05)。与对照组对比,干预组的肿瘤重量也明显变轻,对照组的肿瘤重量为0.936±0.451 g,干预组的肿瘤重量为0.151±0.151 g,两组数据对比也有统计学差异(P<0.05)。(2)两组裸小鼠的皮下成瘤组织切片HE结果显示组织失去正常结构,排列紊乱,细胞异型性大,核浆比例大于1:1,胞浆染色嗜碱增生比较活跃;说明了皮下成瘤模型构建成功。蛋白免疫印迹Western Blot结果显示,与sh Ctrl对照组中SPERT的表达量对比,干预组裸小鼠成瘤组织中SPERT的表达量下降。免疫组化及TUNEL结果显示,与sh Ctrl对照组相比,SPERT敲减后形成的裸鼠皮下肿瘤中Ki67阳性细胞显著减少,凋亡细胞显著增多。这些数据表明,SPERT基因沉默能够抑制人大肠癌细胞RKO在裸鼠体内的肿瘤生长。结论:(1)SPERT基因在结直肠癌患者中癌组织的表达量明显高于癌旁组织,且该基因在结直肠癌患者标本中的表达水平与患者的淋巴转移、远处转移以及病理分期有显著相关,这表明SPERT与结直肠癌患者的病程进展有关,提示该基因是一个有意义的临床指标,其表达水平可以作为患者病理分期临床诊断的指标。(2)敲减SPERT可显著抑制人结肠癌细胞RKO的增殖能力,促进肿瘤细胞的凋亡;提示SPERT基因具有调控大肠癌细胞的增殖和凋亡的双重生物学功能,说明SPERT基因可能是一个潜在的癌基因,对肿瘤细胞的生长、发育和分化的调节起着正调控的作用。(3)通过对应激和凋亡信号通路中关键信号分子进行检测,p38MAPK/HSP27信号通路中p38 MAPK,HSP27蛋白磷酸化水平上升,PARP和Caspase-3蛋白表达水平增加,这些因子在细胞的存活、增殖和凋亡方面具有重要作用。因此,我们推断SPERT基因可能通过调节p38MAPK/HSP27信号通路中的这些因子来介导细胞增殖和细胞凋亡的双重效应功能。(4)异种移植瘤动物模型证实,SPERT基因沉默能够抑制人大肠癌细胞RKO在裸鼠体内肿瘤的生长,表明SPERT沉默在体内和体外有相似的抑制人结直肠癌细胞RKO增殖和促进凋亡的作用。综上所述:SPERT基因是一个比较新的、研究较少的基因,本研究初步揭示了SPERT基因在大肠癌中的功能及其可能的分子机制,提示SPERT基因与大肠癌患者的病程进展有关,在大肠癌中发挥着癌基因的作用,可能是一个潜在的癌基因,在临床上可以作为治疗大肠癌的潜在靶点。