MnSOD基因沉默对H446肺癌干样细胞自我更新和迁移功能的影响

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目的:  研究人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞的生物学特性,探讨转染短发夹RNA(shRNA)表达载体沉默MnSOD基因是否通过影响uPAR表达水平,共同参与肺癌NCI-H446球形成细胞即肺癌干样细胞自我更新和迁移功能,为寻求和研究小细胞肺癌干细胞新型治疗靶标提供参考依据。  方法:  (1)采用无血清干细胞培养基超低黏附板悬浮培养法对人小细胞肺癌NCI-H446细胞系细胞进行初次成球培养,获得原代球细胞,随后进行连续球细胞传代培养,检测NCI-H446细胞系球细胞不同传代培养次数球形成率,选择球形成潜能最高的球细胞作为小细胞肺癌干样细胞模型,用于随后的实验研究;  (2)Western印迹检测NCI-H446细胞系亲本细胞和球形成细胞MnSOD蛋白表达;  (3)创口愈合试验和软琼脂集落形成试验分别检测NCI-H446细胞系亲本细胞和球形成细胞体外迁移和集落形成能力;  (4)采用腺病毒表达技术沉默NCI-H446球形成细胞MnSOD基因,并设置绿色荧光蛋白基因对照组和未处理组,Western印迹检测MnSOD基因沉默效率;  (5)球形成率测定、创口愈合试验和软琼脂集落形成试验分别检测NCI-H446细胞系球形成细胞MnSOD基因沉默后自我更新能力、迁移功能和集落形成能力。  (6)Western印迹检测NCI-H446细胞系球形成细胞MnSOD基因沉默后uPAR表达水平。  结果:  (1)球形成率测定结果显示,NCI-H446第2代球细胞在第3次成球培养时球形成率最高;  (2)Western印迹分析结果显示,与亲本细胞相比,第2代人小细胞肺癌NCI-H446细胞系球形成细胞(肺癌干样细胞)MnSOD蛋白高表达;  (3)创口愈合试验以及软琼脂集落形成试验结果显示,NCI-H446细胞系干样细胞创口愈合率和软琼脂集落形成率高于亲本细胞;  (4)人小细胞肺癌NCI-H446干样细胞uPAR蛋白表达高于NCI-H446亲本细胞;  (5)MnSOD shRNA转染NCI-H446干样细胞,MnSOD蛋白表达明显下调;  (6)MnSOD基因沉默能够有效抑制肺癌NCI-H446干样细胞体外球形成率、细胞迁移率以及软琼脂集落形成率;  (7) MnSOD基因沉默后uPAR表达下调。  结论:  (1)MnSOD蛋白高表达与NCI-H446肺癌干样细胞体外致瘤能力增强相关;  (2)MnSOD基因沉默抑制肺癌NCI-H446干样细胞体外自我更新和迁移能力,并下调uPAR表达。
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