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研究背景和目的肾缺血性损伤是最常见的导致急性肾功能衰竭的原因,死亡率高达50%以上。尽快恢复缺血区的血供,促进血管新生在肾缺血损伤的修复中具有重要的意义。虽已知多种基因、血管生长因子和抑制因子参与血管新生,但其中许多关键环节尚未阐明,使得利用细胞、药物或基因干预等治疗性血管新生的效果未能取得重大突破。研究发现,肾缺血后HIF-1/VEGF信号分子与血管新生密切相关,但其具体作用机制尚不清楚。鉴于Notch信号通路在血管新生中的重要的调控作用,我们推测缺氧/HIF-VEGF-Notch通路可能是介导肾缺血后血管新生的主要信号通路。近年报道,缺氧相关miRNA在内皮细胞上高表达,且能通过VEGF信号促进血管新生。肾缺血后,缺氧相关miRNA能否调控肾脏血管新生及其调控机制尚不清楚。本研究通过构建小鼠肾缺血和HUVEC细胞缺氧模型,观察缺血后缺氧诱导miRNA及HIF-VEGF-Notch信号分子的变化,并通过重组慢病毒载体过表达内皮细胞上特异miRNA,探讨缺氧相关(?)miRNA对血管新生的调控作用及调控途径,以期阐明肾缺血后血管新生的机制。研究内容和方法1体内实验(1)建立Balb/c小鼠急性肾缺血损伤模型。采用夹闭小鼠双侧肾蒂45min制备急性肾缺血损伤模型。于缺血再灌注(I/R)4h、I/R 24h及I/R 72h留取肾组织标本。(2)采用基因芯片技术建立Balb/c小鼠缺血肾组织(?)niRNA的表达谱,采用RT-qPCR验证特异(?)miRNA的表达水平,筛选出差异表达的与血管生成相关miRNA。(3)采用RT-qPCR、Western blot、双重免疫荧光组织化学染色等技术检测肾组织缺氧诱导miRNA、VEGF、VEGFR2、Notch1 mRNA口蛋白表达的变化,免疫组织化学染色检测缺血肾组织CD31表达判断血管新生的情况,以明确肾缺血后,缺氧相关miRNA的表达变化及其与VEGF-Notch信号途径、肾血管新生的关系。2体外实验(1)建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧模型：将常规培养的HUVEC细胞,在1%O2低氧培养箱中培养12h。(2)采用RT-qPCR检测HUVEC缺氧后miR-210、miR-320、miR-126表达变化。采用RT-qPCR、流式细胞、Western blot、免疫细胞化学荧光染色、ELISA等技术检测缺氧后HUVEC中HIF-1α、miR-210靶基因EphrinA3、VEGF及其受体VEGFR2、Notch1及其下游基因hes-1的mRNA和蛋白的表达变化,以进一步明确缺氧后,缺氧相关(?)miRNA参与VEGF-Notch信号途径。(3)构建miR-210重组慢病毒载体,并转染HUVEC使其过表达miR-210。荧光显微镜下观察绿色荧光的阳性率,检测HUVEC中miR-210表达水平,及其靶基因EphrinA3蛋白表达水平,明确重组慢病毒载体能否成功转染HUVEC并过表达miR-210。(4)采用RT-qPCR、流式细胞、Western blot、ELISA等技术检测HUVEC过表达miR-210后VEGF、VEGFR2、Notchl基因和蛋白的表达变化,采用内皮细胞血管形成实验判断内皮细胞形成新生血管的能力,以明确miR-210促进血管新生的作用及对VEGF-Notch信号通路分子的调控作用。结果1成功构建小鼠肾缺血模型：小鼠I/R 24h时,血清SCr、BUN含量达高峰,病理改变可见肾小球明显淤血,肾小管上皮细胞肿胀变性,出现刷状缘脱落、核深染、裸露,严重者可见细胞片状坏死,脱落,基底膜不完整；部分肾小管管腔扩张,腔内见上皮细胞碎片和管型。结合肾功能及肾脏病理变化表明肾缺血模型成功建立。2通过建立缺血肾组织miRNA表达谱,发现了与肾缺血后血管新生相关的miRNAs:76个miRNAs出现两倍以上的表达变化,有40个(?)niRNAs表达下调,36个miRNAs表达上调。其中miR-210、miR-320、miR-126等与血管新生密切相关。表明miRNA的变化与肾缺血密切相关,并可能介导肾缺血后血管新生3肾缺血损伤可导致反应性血管新生,缺氧诱导miRNA及其介导的HIF-VEGF-Notch信号系统出现明显变化：肾组织中(?)niR-210、miR-126表达明显上调,miR-320表达明显下调,VEGF、VRGFR2、Notch1 mRNA口蛋白表达水平均上调,CD31表达亦上调。初步明确肾缺血后缺氧相关(?)miRNAs可能通过VEGF-Notch信号途径调控肾血管新生。4缺氧可导致内皮细胞中缺氧诱导(?)niRNA及HIF-VEGF-Notch信号分子出现明显改变：HUVEC缺氧后miR-210、miR-126表达上调,miR-320表达下调,EphrinA3蛋白表达下调,VEGF、VEGFR2、Notch-1、hes-1、HIF-1α的基因和蛋白的表达均上调。进一步提示缺氧后,缺氧相关miRNA可参与HIF-VEGF-Notch信号途径5过表达内皮细胞miR-210,可激活VEGF-Notch信号通路促进血管新生：(1)重组慢病毒载体转染HUVEC后,荧光显微镜下GFP阳性率在80%以上。miR-210表达水平明显上调,其靶基因EphrinA3蛋白表达下调,证实重组慢病毒载体成功转染HUVEC并过表达miR-210。(3) HUVEC中过表达miR-210后VEGF、VEGFR2、Notch-1 mRNA和蛋白的表达均上调,血管内皮细胞形成新生血管的能力增强。表明miR-210通过调控HUVEC中VEGF-Notch信号通路促进血管新生。结论本研究针对肾缺血损伤修复中的血管新生这一关键问题,通过体内外系列实验,对肾血管新生分子机制进行了深入探讨,综合实验结果得出以下结论：1建立了缺血肾组织miRNA表达谱,发现了与肾血管新生相关的miRNA。2 HIF-VEGF-Notch信号通路是调控肾缺血后血管新生的主要通路。3 miR-210主要通过调控VEGF-Notch信号通路来调控新生血管形成。4本研究结果为治疗性的血管新生提供了理论基础及新的药物靶点。