【摘 要】
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目的:饲养层培养后得到的条件培养液具有维持人胚胎干细胞不分化的作用.为了阐明条件培养液维持人胚胎干细胞不分化的可能机制,该文将用双向电泳、质谱技术对鼠胚胎成纤维细
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目的:饲养层培养后得到的条件培养液具有维持人胚胎干细胞不分化的作用.为了阐明条件培养液维持人胚胎干细胞不分化的可能机制,该文将用双向电泳、质谱技术对鼠胚胎成纤维细胞的条件培养液进行蛋白质组学分析,以找出其中可能的具有抑制分化作用的蛋白因子.方法:用60Coγ-射线照射昆明白小鼠胚胎成纤维细胞,制成饲养层.用ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒钠盐)培养液培养鼠胚胎成纤维细胞饲养层24小时,得到条件培养液.低温冷冻干燥使条件培养液浓缩,Sephadex G-50中凝胶过滤层析去除浓缩液中的盐分,冷丙酮沉淀的方法将层析洗脱液中的蛋白质沉淀.所得的蛋白样品用于双向电泳.银染得到双向电泳图谱,用Imagemaster elite2.0软件进行图像分析.选取双向电泳图谱上的蛋白点,原位酶解,用CapLC-ESI-Q-TOF质谱进行分析,将结果输入NCBInr数据库,使用Mascot软件中的串联质谱数据搜索功能进行搜索并输出搜索鉴定的结果.结果:用冷冻干燥、凝胶过滤层析、冷丙酮沉淀的方法从鼠胚胎成纤维细胞条件培养液中提取的蛋白质样品,能适用于双向电泳.双向电泳得到221±67个蛋白点的银染图谱,蛋白质的等电点和分子量总体上分布广但不均匀,大部分蛋白质集中于分子量MW20kDa~70kDa,等电点pI 4~8的区域.用质谱初步分析鉴定了其中13个蛋白点,结果为3个角蛋白,3个转铁蛋白,1个胰酶前体,2个未知蛋白(3个蛋白点),1个缝隙连接蛋白,1个β-半乳糖苷结合蛋白,1个半胱氨酸富集的酸性分泌蛋白SPARC.结论:昆明白小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液中含有缝隙连接蛋白、β-半乳糖苷结合蛋白、半胱氨酸富集的酸性分泌蛋白SPARC.其中,半胱氨酸富集的酸性分泌蛋白SPARC可能与条件培养液维持人胚胎干细胞不分化的作用相关.
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