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【研究目的】探讨自噬在甲苯二异氰酸酯诱导人气道上皮细胞炎性反应及气道重塑中的作用,为TDI哮喘的发病机制研究提供新思路,为进一步对职业性哮喘进行预防和治疗提供方向。【研究方法】通过合成TDI-人血清白蛋白(Human serum albumin,HSA)偶联物并用Gutmann法检测TDI-HSA偶联物中TDI的浓度,BCA法检测TDI-HSA偶联物中HSA含量。应用不同浓度的TDI-HSA及HSA刺激人支气管上皮细胞(16HBE),通过细胞生存率实验(CCK-8)确定最高染毒浓度,利用流式细胞仪、ELISA实验检测不同浓度下16HBE细胞ROS表达水平及炎性反应水平;利用透射电镜、Western blot实验检测16HBE细胞暴露于不同浓度TDI-HSA后自噬活化情况。确定最佳染毒浓度后,探讨自噬抑制剂3-methyladenine(3-MA)及自噬激动剂rapamycin(Rapa)对16HBE细胞炎性反应和气道重塑的影响。实验分为五组:溶剂对照组、TDI-HSA组、Rapa组、TDI-HSA+Rapa组和TDI-HSA+3-MA组。CCK-8法检测各组细胞存活率;利用透射电镜、Western blot实验检测自噬;GFP-RFP-LC3腺病毒转染16HBE细胞后检测自噬流的变化;ELISA法及免疫荧光法检测各组细胞炎性反应;Western blot法检测各组细胞气道重塑相关蛋白表达水平。【研究结果】1.TDI质量浓度的测定。本研究中合成的TDI-HSA中TDI的质量浓度为18.30μg/mL,HSA质量浓度为1650μg/mL,TDI与HSA的摩尔比为4.33。本研究中TDI-HSA质量浓度均以其中HSA的质量浓度表示。40μg/mL TDI-HSA组中TDI的质量浓度为0.44μg/mL,80μg/mL TDI-HSA组中TDI的质量浓度为0.89μg/mL,120μg/mL TDI-HSA组中TDI的质量浓度为1.33μg/mL。2.细胞生存率实验。利用CCK-8检测不同浓度TDI-HSA对16HBE细胞生存率的影响,结果表明浓度为120μg/mL及以下时,不同剂量的TDI-HSA组或HSA组的细胞存活率分别比较,以及相同剂量TDI-HSA组和HSA组的细胞存活率分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。TDI-HSA组和HSA组在剂量为120μg/mL以下不影响细胞存活率。3.TDI-HSA对16HBE细胞ROS及IL-4、IL-6表达水平的影响。经不同浓度TDI-HSA(40、80、120μg/mL)处理16HBE细胞24h后ROS、IL-4和IL-6表达水平均显著高于同浓度HSA组,且16HBE细胞的ROS、IL-4和IL-6表达水平均随着TDI-HSA剂量的增加均显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。4.TDI-HSA对16HBE细胞自噬水平的影响经不同浓度TDI-HSA(40、80、120μg/mL)处理16HBE细胞24h后,透射电子显微镜未观察到对照组(0μg/mL)及同浓度HSA组16HBE细胞内自噬相关结构,而不同浓度TDI-HSA组16HBE细胞内自噬溶酶体数量明显增多,线粒体空泡化数量增加。Western blot法检测结果表明,与对照组比较,不同浓度TDI-HSA组16HBE细胞中Beclin1蛋白相对表达水平及LC3β-II/I比值均升高,P62蛋白表达水平下降,HMGB1及RAGE蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着TDI-HSA浓度的增加,Beclin1和HMGB1蛋白表达水平显著增加,LC3β-II/I比值显著降低,P62蛋白表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。5.不同受试物对16HBE细胞细胞毒性的影响。CCK-8检测结果表明,与对照组相比,TDI-HSA组,TDI-HSA+Rapa组,TDI-HSA+3-MA组和Rapa组细胞生存率均保持在90%以上,表明不同受试物对16HBE细胞无明显细胞毒性。6.GFP-RFP-LC3β转染16HBE细胞观察自噬流GFP-RFP-LC3β双标腺病毒转染16HBE细胞后,经荧光显微显微镜观察,TDI-HSA刺激后进行下黄色斑点与红色斑点定量,结果显示对照组检测到少量自噬体和自噬溶酶体;TDI-HSA处理组,出现大量黄色及红色斑点;用3-MA抑制自噬后,自噬体及自噬溶酶体数量明显减少,自噬减轻;Rapa可主动激活自噬的发生,与TDI-HSA刺激细胞结果效应相同。7.不同受试物对对16HBE细胞自噬的影响。Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3-II/I比值的变化以评估自噬的发生。与对照组相比,TDI-HSA组LC3-II/I比值显著升高,beclin1蛋白表达显著增加(P<0.05)。与TDI-HSA组相比,TDI-HSA+RAPA组LC3-II/I比值显著升高,beclin1蛋白表达升高(P<0.05),表明自噬活性增强;TDI-HSA+3-MA组LC3-II/I比值显著降低,beclin1蛋白表达降低(P<0.05),表明自噬活性降低。8.自噬对TDI-HSA诱导的16HBE细胞炎症反应的影响。ELISA检测结果表明,与对照组相比,TDI-HSA组16HBE细胞IL-5、IL-6和IL-8表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与TDI-HSA组相比,TDI-HSA+Rapa组16HBE细胞IL-5、IL-6和IL-8表达水平显著升高(P<0.05);TDI-HSA+3-MA组16HBE细胞IL-5、IL-6和IL-8表达水平显著降低(P<0.05)。免疫荧光检测结果表明,与对照组相比,TDI-HSA组16HBE细胞caspase-1和NLRP3数量显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);与TDI-HSA组相比,caspases-1和NLRP3数量在TDI-HSA+Rapa组表达显著升高,在TDI-HSA+3-MA组表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。9.自噬对TDI-HSA诱导的16HBE细胞气道重塑指标的影响。Western blot检测结果表明,与对照组相比,TDI-HSA组16HBE细胞E-cadherin蛋白表达减少,vimentin、α-SMA、MMP-9和Mucin5AC蛋白表达显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。与TDI-HSA组相比,TDI-HSA+Rapa组16HBE细胞E-cadherin蛋白显著减少,vimentin、α-SMA、MMP-9和Mucin5AC蛋白表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);TDI-HSA+3-MA组16HBE细胞E-cadherin蛋白表达显著增加,vimentin、α-SMA、MMP-9和Mucin5AC蛋白表达显著减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。【研究结论】1、TDI可诱导16HBE细胞ROS表达水平升高并诱导自噬的活化。2、TDI可诱导16HBE细胞炎性反应、促进EMT过程及MMP-9、Mucin5AC蛋白表达,抑制自噬可降低TDI诱导的气道炎性反应及气道重塑相关蛋白的表达。