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研究背景： 肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)为泌尿系统三大恶性肿瘤之一，发病率约5～10/10万，且每年以2％的速度递增。RCC约占全身恶性肿瘤的3％，占肾脏原发性恶性肿瘤的85％，其死亡率超过40％。早期RCC患者手术切除后，仍有20％-30％将发生转移。转移性RCC预后较差，中位生存期6～12个月，5年生存率仅9％。因此，侵袭性转移是RCC患者治疗失败的主要原因，所以有效控制侵袭转移是治疗RCC的关键。 HOX家族中LncRNA-HOTAIR是第一个被发现具有反式作用的长链非编码RNA(longchain noncoding RNA，LncRNAs)，它能同时结合多梳抑制复合体2(polycomb repressive complex2，PRC2)和组蛋白去甲基化酶复合体[赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1(lysinespecific demethylase1，LSD1)/RE1-沉默转录因子(RE1-silencing transcription factor，REST)共阻抑蛋白(Co-repressor of REST，CoREST)/REST]，并介导这2种复合体结合到特异性的基因组位点，分别使染色体组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(histone H3tri-methylated at lysine27，H3K27me3)和组蛋白H3第4位赖氨酸二甲基化(histone H3dimethyl Lys4，H3K4me2)，继而导致基因沉默。 近年来的研究表明，HOTAIR通过调控组蛋白的甲基化或乙酰化修饰作用介导了乳腺癌、肝癌和结肠癌肿瘤的转移过程。还有研究发现:在肾癌样本中可检测到HOX基因表达异常，同时，组蛋白异常的甲基化和乙酰化参与了肾癌侵袭转移，这提示HOX基因表达异常和组蛋白的异常乙酰化可能是肾癌的发生发展、侵袭转移过程的重要事件之一;现已明确姜黄素可以通过干扰组蛋白纠正组蛋白异常的甲基化和乙酰化来发挥抗癌作用。而其深入的机制如何，目前尚不清楚。因此，文本假设姜黄素通过干扰HOTAIR介导组蛋白乙酰化从而抑制肾癌侵袭转移。 目的： 本研究拟检测HOTAIR在肾癌组织中的表达水平，并从体内外研究HOTAIR对肾癌细胞增殖和趋化运动迁移能力的影响。在此基础上，研究姜黄素对HOTAIR介导的RCC增殖和细胞迁移运动能力的影响。姜黄素是从姜科植物姜黄中提取出来的一种酚类色素，近年来的研究表明，姜黄素不仅具有抗凝、降血脂、抗氧化、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抗类风湿、保肝利胆护胃等多方面作用，而且能够抑制恶性肿瘤的侵袭、转移，但具体机制尚未阐明。本文对姜黄素是否能影响HOTAIR介导的肾癌迁移运动能力进行了研究，以期对临床应用姜黄素治疗转移性RCC以及靶向治疗等研究提供新思路和新靶点。 方法： 1.预实验:收集17例临床手术标本（每例均包括肾癌原发灶、肾门转移淋巴结病灶、癌旁正常肾组织），检测HOTAIR的表达情况，考察肾门淋巴结转移灶、肾癌组织、癌旁肾组织中的HOTAIR是否表达及其差异。 2.考察实验室常用的6种人肾癌细胞株(os-rc-2、ACHN、769-P、Kert-3、786-O、a498)中HOTAIR表达情况及其增殖和迁移运动能力，筛选出低表达低迁移能力的细胞株769-P和高表达高迁移能力的细胞株786-O作为研究对象，运用慢病毒(pLenti GFPPuro-HOTAIR)转染肾癌细胞系769-p后，构建稳定高表达HOTAIR的细胞株769-p-HOTAIR，再运用shRNA干扰786-O中的HOTAIR，构建稳定沉默HOTAIR的细胞株786-O-siRNA，选择在不影响增殖、凋亡情况下，分别考察它们体外运动迁移能力。 3.选择769-P、769-P-NC、769-P-HOTAIR和786-O、786-O-NC、786-O-siRNA进行瘤鼠模型的建立，考察他们在体内增殖力和转移能力。以及体外、内实验考察姜黄素对细胞株的迁移运动能力和各组瘤鼠的抑制影响情况。 结果： 1.各样本组HOTAIR mRNA均有表达，转移灶HOTAIR的表达显著高于肾癌原发灶(P=0.0086)和癌旁正常肾组织(P=0.0060);肾癌原发灶与癌旁正常肾组织中HOTAIRmRNA的表达组间无显著差异性(p=0.281)。 2.正常肾细胞HK-2 HOTAR的表达水平明显低于三种肾癌细胞株os-rc-2(P=0.0173)、kert-3(P=0.0011)和786-O(P=0.0003)，高转移性肾癌细胞系(os-rc-2，786-O)中HOTAIR的水平明显高于低转移性肾癌细胞株(achn，769-p)。os-rc-2与achin、769-p比较，P值分别为:0.0186和0.0146;786-O与achin、769-p比较，P值分别为:0.004和0.0007。 3.Transwell小室试验检测五种肾癌细胞系迁移运动能力，786-O、kert-3细胞迁移运动能力均较强，与769-p细胞比较，均具有显著差异，P值分别为0.0002，0.0006;与achn细胞比较，均具有显著差异，P值分别为0.0035，0.004;与os-rc-2细胞比较，均具有显著差异，P值分别为0.0042，0.0022; 4.携带HOTAIR的慢病毒载体感染的769-p细胞的HOTAIR明显高表达(P=0.0005)，而携带vector的慢病毒载体感染的769-p细胞的HOTAIR水平无明显变化(P=0.4810)。两组稳定转染的786-O-siRNA细胞株HOTAIR mRNA表达水平显著低于对照组786-O细胞的HOTAIR mRNA表达水平，(P=0.0003，P=0.00037，)，而阴性对照NC(siGFP)的786-NC细胞，HOTAIR水平变化不明显(P=0.1904)。 5.在24h和48h769-p-HOTAIR、769-p-NC、769-p细胞增殖情况组间比较无显著差异，在72h769-p-HOTAIR组相比769-p、769-p-NC组，细胞增殖的差异有统计学意义(p=0.00536，p=0.0092)，此外，769-p-NC组与769-p组也有显著性差异(p=0.0078)。在24h，786-O-shHOTAIR、786-O-NC、786-O细胞增殖情况组间比较无显著差异，在48h和72h，786-O-shHOTAIR组相比786-O-NC、786-O组，细胞增殖的差异有统计学意义。786-O-shHOTAIR在48h相比786-O组，细胞增殖减少(p=0.0084)，在72h相比786-O组，细胞增殖减少(p=0.0002);786-O-shHOTAIR在48h相比786-O-NC组，细胞增殖显著性减少(p=0.0042)，在72h相比786-O-NC组，细胞增殖显著性减少(p=0.00018);此外，786-O-NC组与786-O组在48h、72h有显著性增加(p=0.0067， p=0.0053)。 6.769-p-HOTAIR相比769-p-NC、769-p细胞株，迁移运动能力显著增加，P值分别为0.0031，0.0017。769-p-NC与769-p细胞株的迁移运动能力无显著性差异。786-O-shHOTAIR相比786-O-NC、786-O细胞株，迁移运动能力显著降低，P值分别为0.0034，0.0021。786-O-NC与786-O细胞株的迁移运动能力无显著性差异。 7.体内实验显示:786-O和786-o-NC组肿瘤体积、瘤重、生长速度的增加幅度比786-o-shRNA大，差异具有统计学意义。769-p-HOTAIR组肿瘤体积、瘤重、生长速度增加的幅度比769-p、769-p-NC大，差异具有统计学意义。 8.姜黄素对4株人肾癌细胞769-p、769-p-vector、769-p-HOTAIR和786-O的体外实验:姜黄素对四种肾癌细胞的生长具有抑制作用，且呈时间-剂量依赖性。姜黄素终浓度＞10μM时，细胞生长抑制作用显著，且差异有统计学意义(P=0001～0.0083);姜黄素终浓度≤10μM，在24 h内对细胞的生长无明显抑制作用。transwell小室法检测结果显示，姜黄素对769-p-HOTAIR、786-O两种细胞迁移运动均有抑制作用，且呈明显的剂量依赖性。在姜黄素终浓度≥5μ M时，对细胞迁移运动的抑制作用与对照组相比差异显著，有统计学意义(P=0017～0.0030)。然而，同样条件下，姜黄素(5-10μ M)对Kert细胞的迁移运动无明显抑制作用(P=0831～0.1341)。 结论： LncRNA-HOTAIR介导肾癌细胞的增殖和侵袭转移的过程，同时本研究还证实姜黄素可以抑制HOTAIR介导RCC侵袭转移的过程，姜黄素可能成为有潜力的抗肾癌侵袭转移药物，并从其他中药低毒抗肾癌转移的药物提供一定的理论与实验依据。