室内环境污染问题成为现代社会影响人们身体健康和安全的主要问题。室内灰尘作为室内多种有害微生物和污染物的反应媒介和附着载体,受到了越来越多的关注。已有研究证实室内灰尘中含有数百种污染物,并且污染物的浓度与某些疾病发病的严重程度有显著的相关性。流行病学研究发现室内灰尘暴露会引起人类的呼吸系统、神经系统、心血管系统、免疫系统及生殖系统疾病的疾病,然而室内灰尘暴露对人角膜疾病的发生关系的报道极少,室内灰尘诱导角膜上皮细胞损伤的分子机制仍然鲜见报道。在室内灰尘毒理学研究中多数采用癌细胞和永生化细胞系,然而癌细胞和永生化细胞由于长时间在体外培养,很多生理特征发生了显著变化。基于此,我们收集了南京市区家庭灰尘和办公室灰尘,分析和比较了目标污染物在不同类型室内灰尘中的污染水平,重点研究了室内灰尘暴露角膜上皮(HCE)细胞后的细胞毒性效应和分子机制;并对室内灰尘中高频检出的有机磷阻燃剂诱导的角膜上皮细胞凋亡机常制进行了深入探讨。本研究结果可为了解南京市室内灰尘污染特征提供参考,为预防室内灰尘暴露诱导的角膜健康影响提供重要理论指导。本课题的主要内容如下:(1)本研究采集了南京市市区居民家庭和商业办公室中空调滤网灰尘,并分别对其理化性能和污染物(10种重金属,16种多环芳烃,16种有机氯农药,5中邻苯二甲酸酯和5种有机磷阻燃剂)含量进行测定与比较。结果发现,除Sb外,办公室灰尘中9种(Pb,Cu,Cd,Zn,Cr,Ni,Co,As,Mn,Ni)重金属的含量和生物有效态(水溶性部分)含量要高于家庭灰尘;办公室灰尘中16种多环芳烃的总含量为25.3 mg/kg,显著高于家庭灰尘中多环芳烃的总含量,约为家庭灰尘中7.94 mg/kg的3倍,办公室灰尘的TEQs值约为家庭灰尘的5.4倍,提示办公室灰尘暴露后的致癌风险要显著高于家庭灰尘。办公室灰尘中的5种磷代阻燃剂总含量也较于家庭灰尘高(5.94v.s.4.74mg/kg)。而家庭灰尘中的16种有机氯农药总含量却高于办公室灰尘(10.9v.s.3.45mg/kg);两种室内灰尘中总有机碳含量接近,但是家庭灰尘的平均粒径几乎为办公室灰尘的两倍(58.5 v.s.20.9μm)。(2)本研究以家庭灰尘为研究对象,配制浓度为5,10,20,40,80,160,320μg/100 μL的灰尘暴露液,处理人角膜上皮细胞24 h后,观察细胞形貌,细胞活力变化,分析氧化应激标志物(活性氧、丙二醛、8-羟化脱氧鸟苷)含量变化,检测抗氧化酶和炎症介导子基因表达和线粒体膜电位的改变情况。结果发现家庭灰尘诱导浓度依赖性的细胞活力降低和活性氧含量增加;当灰尘浓度>20-80 μg/100μL时家庭灰尘引起了活性氧、丙二醛和8-羟化脱氧鸟苷含量的显著增加;抗氧化酶和炎症介导子基因在灰尘暴露后也发生了显著的改变;随着灰尘暴露浓度的增加,细胞线粒体膜电位降低率从9.2%到82%。鉴于该研究结果,我们推断家庭灰尘暴露可以诱导人角膜上皮细胞氧化损伤和炎症反应,并且引起细胞线粒体功能异常,继而诱发细胞毒性。在该研究中,我们采用的人正常HCE细胞相关癌细胞或永生化的细胞系更为接近正常生理状态,所以得到的结果更为准确。(3)在本研究中,我们配制了家庭灰尘和办公室灰尘的有机提取液和水提取液。以浓度分别为16,48,144,432,1296μg/100μL的两种灰尘的水提取和有机提取液分别暴露HCE细胞24h和72 h,利用CCK-8检测细胞活力并计算各提取液的LC50值;根据结果选择48 μg/100 μL作为后期深入研究的浓度,并对该浓度暴露下,细胞的氧化应激标志物生成,抗氧化酶活力,多环芳烃受体信号通路关键基因和炎症基因的mRNA表达和NF-κB信号通路中关键蛋白p65的转核情况进行检测,深入比较不同灰尘的不同提取液暴露HCE细胞后的细胞应答差异。结果显示不同的灰尘提取液均能引起人角膜上皮细胞毒性,氧化应激,炎症反应,并激活AhR和下游代谢相关调控基因CYP1A1和CYP1BI,同类型提取液相比发现办公室灰尘的毒性要高于家庭灰尘。除了家庭灰尘的水提取液外,所有其他提取液均能激活NF-κB信号通路,诱导p65转核。总之,有机提取液的细胞毒性比水提取液强,办公室灰尘比家庭灰尘致毒风险高。(4)本研究以毒性较强的灰尘有机提取液中高频检出的有机磷阻燃剂TDCPP为研究对象,制备浓度分别为0.034,0.34,3.4,34,68,136,272,340 μg/mL的TDCPP细胞暴露液,对细胞进行24 h暴露后,检测细胞活力变化,计算LC50值;根据结果选择1/100 LC50,1/10 LC50和LC50三个浓度进行分子机制的深入研究。研究结果发现,当TDCPP浓度>68 μg/mL时细胞活力才收到明显抑制,当TDCPP浓度>272 μg/mL时,细胞活力降低至87%,发现TDCPP暴露人角膜上皮细胞后可以显著降低细胞活力并引发细胞的凋亡。内质网应激相关标志基因在TDCPP暴露后被显著诱导表达,而内质网压力诱导的眼表细胞凋亡与众多眼病的发生有关。我们的结果发现TDCPP暴露后促进凋亡蛋白表达增强而抗凋亡蛋白表达降低进一步证实了 TDCPP暴露后HCE细胞凋亡的发生。此外,线粒体膜电位的降低,细胞内ATP含量的降低和caspase-3和9活力的增强均在TDCPP暴露后发生。总之,研究表明,内质网应激与TDCPP诱导的人角膜上皮细胞凋亡有关,该凋亡可能由线粒体凋亡通路介导。人们长期暴露在富含TDCPP的灰尘中,且随着TDCPP更为广泛的使用,其人体健康效应需多加关注,因此深入全面地研究其对人眼表的毒性影响和机制具有重要意义。