公猪生殖力表现为季节性变化。在炎热的夏季，公猪精液品质降低，生殖力低下。升高的环境温度会诱发公猪精液品质的改变，比如精子活力降低和精子顶体完整率下降以及精子畸形率升高。因此，揭示热应激对睾丸生精细胞损伤机制，寻找缓解或预防热应激的方法具有一定生产意义。热通常诱导细胞产生活性氧簇(ROS)，包括超氧化物自由基、过氧化氢和羟基自由基。当活性氧簇产生量超过机体细胞抗氧化系统清除能力时，组织细胞就会产生氧化应激。睾丸组织中的多余ROS可被细胞内多种抗氧化酶清除，例如谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、血红素加氧酶1(OH-1)、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基(GCLC)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)等。红系衍生的核因子2相关因子2（Nrf2）在各组织细胞抗氧化应激反应中处于核心地位。近年研究发现，激活Nrf2-ARE抗氧化信号通路可上调细胞内抗氧化酶类基因的表达，如HO-1、NQO1和GCLC增强细胞抗氧化能力，发挥抗氧化作用。在众多Nrf2诱导物中，叔丁基对苯二酚(tBHQ)可通过Nrf2激活许多下游抗氧化基因的表达。因此，通过Nrf2诱导剂tBHQ上调睾丸组织中抗氧化酶，进而提高细胞抗氧化能力，不失为一个有效预防热应激的方法。本试验首先通过精液品质检测研究夏季高温对公猪精子生成的影响，然后采用免疫组织化学染色法检测了Nrf2蛋白在小鼠睾丸组织中表达，并利用RIA、RT-PCR等方法检测了热应激小鼠睾丸的相对重量，氧化应激参数，Cleaved caspase 3阳性表达细胞数量以及Nrf2及其相关基因的表达，就tBHQ可能的缓解机制进行了深入分析研究。主要研究结果如下:　　1.夏季高温对大白公猪精子生成的影响　　为了阐明夏季高温环境导致公猪精液质量低下的机理，本试验选用5头性成熟大白公猪，并施以3天连续高温暴露。热暴露前2周和热暴露后6周，每间隔3天，采集精液1次，并检测精液品质:精液体积、精子总数、精子活力、精子畸形率、精浆成分，以及精浆和血清中睾酮浓度。试验结果表明，与热暴露前相比，大白公猪热暴露后第2周末，精子总数显著降低(P＜0.05)。精子畸形率在大白公猪热暴露第3到第5周期间，显著升高(P＜0.05)，而精子活力显著下降(P＜0.05)。另外，精液体积，血清中睾酮含量，大白公猪精浆中离子浓度以及总蛋白和白蛋白含量在热暴露前后都没有显著变化。大白公猪精子畸形率和精子活力在热暴露6周后逐渐恢复正常值。试验结果表明，大白公猪热暴露可能损害精母细胞和精细胞的发育，进而扰乱公猪精子生成，降低了公猪精液品质。　　2.全身热应激对小鼠睾丸组织损伤及Nrf2保护作用的研究　　本研究旨在阐明热应激小鼠睾丸中Nrf2与热应激诱导的氧化应激的关系。雄性小鼠每天暴露于高环境温度(42℃)中2小时。连续12天热处理，分别于热处理后第1、2、4、8和12天，采集睾丸样品，测定睾丸重量，睾丸组织抗氧化酶活性和丙二醛和谷胱甘肽含量;利用免疫组织化学方法检测Nrf2蛋白的表达，利用实时定量PCR方法检测Nrf2及其下游调控基因的表达。热处理后，小鼠直肠、阴囊表面和体表温度显著增加。随着热处理天数的增加，血清中皮质醇和睾酮的浓度出现波动。持续12天高温处理导致小鼠体重和睾丸重量显著下降，丙二醛含量显著升高，过氧化氢酶活力显著下降;热处理第4天，睾丸组织谷胱甘肽含量显著增加;总超氧化物歧化酶和铜锌超氧化物歧化酶的活性在第8天和第12天热处理后显著增加。此外，小鼠热处理后第3天，睾丸组织中生精上皮细胞以及间质细胞中Nrf2表达强烈，尤其间质组织中Nrf2蛋白发生明显入核;Nrf2及其下游调控基因HO-1和GCLC显著升高。结果表明热应激可减少睾丸组织重量，引起睾丸组织氧化应激，胞质胞核中强烈表达的Nrf2以及增加的抗氧化基因表达暗示Nrf2可能是保护生殖细胞和间质细胞免受氧化应激的一个新的靶点。　　3.阴囊热应激小鼠对睾丸组织损伤及Nrf2保护作用的研究　　为了阐明热应激对小鼠睾丸Nrf2-ARE抗氧化系统的影响。本试验设计利用8周龄ICR小鼠施以一次阴囊42℃下25min水浴热处理，并在热处理后的3h、1、2、7和14天后，采集小鼠睾丸组织样品进行组织形态学，免疫组织化学以及实时定量PCR等分析。热应激导致小鼠睾丸生精上皮严重损伤，主要表现为产生多核巨细胞和生精细胞脱落。氧化应激指标丙二醛含量在热处理后3h和第1天显著增加;睾丸组织谷胱甘肽含量和谷胱甘肽过氧化物酶超氧化物歧化酶以及铜锌超氧化物岐化酶在热处理后都出现显著性降低;小鼠热应激后第1天和第2天，睾丸组织中Cleaved caspase 3蛋白阳性细胞比率显著增加;小鼠阴囊热应激还诱导了Nrf2蛋白表达，尤其间质细胞中表达明显;小鼠热应激后第1天，睾丸组织Nrf2及其相关调控基因GCLC和NQO1相对表达量显著升高。以上结果表明，小鼠阴囊热应激诱导睾丸组织氧化应激，损伤睾丸生精上皮，并伴随Nrf2-ARE抗氧化信号通路的激活。　　4.tBHQ不同处理方法对阴囊热应激小鼠睾丸损伤的保护作用　　为了研究tBHQ对阴囊热应激诱导的小鼠睾丸组织损伤的影响，本试验利用8周龄雄性ICR小鼠，分别通过预饲喂1周添加tBHQ(1％w/w)的日粮，腹腔预注射tBHQ（100mg/kgBW），或者睾丸预注射tBHQ（12.5mg/kgBW）的方法，建立小鼠tBHQ给药模型。小鼠tBHQ预处理后，施以阴囊热处理(42℃，25min)。阴囊热应激48h后，采集血清和睾丸组织样品分析。与对照组相比，日粮饲喂和腹腔注射tBHQ组小鼠睾丸组织具有相对紧凑的间质组织和相对完好的生精上皮结构。睾丸注射tBHQ导致睾丸组织疏松和大量生精小管塌陷。另外，三种方法的tBHQ预处理都导致了睾酮浓度降低和细胞色素P45017α-羟化酶/17，20-裂解酶(CYP17)的表达下降。这一结果表明，tBHQ可能通过抑制类固醇合成导致睾酮分泌减少。通过日粮饲喂或腹腔注射tBHQ能一定程度上缓解阴囊热应激造成的睾丸组织损伤，并且适量的tBHQ可成为缓解雄性动物睾丸组织热应激的有效抗氧化剂。　　5.tBHQ激活Nrf2信号通路对阴囊热应激小鼠睾丸损伤保护作用的研究　　本文旨在揭示预饲tBHQ对Nrf2-ARE信号通路的影响以及tBHQ缓解阴囊热应激小鼠睾丸组织可能的机制。阴囊热应激前，8周龄ICR小鼠预饲喂1周添加tBHQ(1％w/w)的日粮。饲养结束后，给试验小鼠施以单次阴囊热处理(42℃，25min)，然后在热处理后的3h、1天、2天和7天，采集血清和睾丸样品。预饲tBHQ可以维持阴囊热应激小鼠睾丸组织的完整性，表现为相对紧密的间质和相对完整的生精上皮。预饲tBHQ使小鼠睾丸丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量以及谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶(CAT)活力显著升高。阴囊热应激处理后，预饲tBHQ组小鼠睾丸组织MDA含量显著低于未预饲tBHQ组小鼠，并且GSH含量以及CAT酶活力显著高于未预饲tBHQ组小鼠。另外，与未预饲tBHQ组小鼠相比，预饲tBHQ使小鼠睾丸组织间质Nrf2明显表达，并且Nrf2及其调控基因HO-1和NQO1中mRNA表达显著增高。上述结果表明，tBHQ预处理可能通过诱导小鼠睾丸组织产生氧化应激，诱导细胞内酶类和非酶类抗氧化物质上调，并激活Nrf2-ARE抗氧化通路，进而增强细胞抗氧化能力，从而缓解阴囊热应激诱导的睾丸组织损伤。