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选题依据:黄芪最先记录于《神农本草经》,被视为上等品,至今为止作为药物使用已有2000多年,为临床要药,拥有“十方八芪”之说,被列入国家60个战略性重点品种和18个商务部中药材重点品种流通分析品种,且在2018年列入国家药食同源目录。目前中国国内黄芪废渣年产生量达到数万吨,且逐年攀升。与其它高等植物中的细胞壁半纤维素成分木葡聚糖(无活性)不同,课题组在前期研究中发现,黄芪药渣细胞壁半纤维素中主要是阿拉伯木聚糖,目前已有研究证明,从谷物种皮中提取的该类糖对肿瘤细胞具有较强的抑制作用,而且黄芪药渣中的阿拉伯木聚糖约占黄芪药渣10%,比已开发为肿瘤化疗后升高白细胞药物黄芪细胞质可溶性阿拉伯半乳聚糖(注射用黄芪多糖)含量高1000倍。因此,开发黄芪药渣中阿拉伯木聚糖抗肿瘤高附加值产品,对实现中药黄芪资源的良性循环利用将有重大意义。目的:从黄芪药渣四种不同种类阿拉伯木聚糖中筛选出活性阿拉伯木聚糖,并对活性阿拉伯木聚糖进行体外细胞实验和体内动物实验,评价其抗肿瘤活性,进一步对活性阿拉伯木聚糖进行降解获得寡糖,对其进行结构解析及活性评价,获得高活性寡糖,为开发黄芪药渣中阿拉伯木聚糖抗肿瘤高附加值产品,实现中药黄芪资源的良性循环利用奠定基础。研究方法与研究内容:体外细胞实验采用MTT法检测黄芪药渣中四种不同种类阿拉伯木聚糖对人肺腺癌A549细胞的增殖抑制作用,对活性阿拉伯木聚糖进行抗肿瘤活性评价,包括划痕实验、细胞周期及细胞凋亡实验,qRT-PCR和Western blot实验。体内动物实验研究活性阿拉伯木聚糖AX-I-3对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用,包括ELISA试剂盒对血清中相关细胞因子变化水平的检测,HE染色对肿瘤组织病变情况检测,流式细胞仪对脾脏T淋巴细胞变化检测,qRT-PCR及Western blot技术对P53、Bax、Bcl-2、Caspase-3及Cyt-C蛋白表达进行测定。将活性阿拉伯木聚糖进行酸降解获得寡糖,解析其结构并通过MTT法筛选出高活性寡糖,进而对其通过细胞周期及凋亡实验,qRT-PCR和Western blot实验评价其抗肿瘤活性。研究结果:1、采用MTT法对黄芪药渣中四种不同种类阿拉伯木聚糖AX-I-1~AX-I-4进行体外抗肿瘤活性筛选,发现AX-I-3组分多糖对A549细胞具有一定的增殖抑制作用,且当给药浓度为400μg/mL时,对A549细胞杀伤作用较强,对BEAS-2B细胞的细胞毒作用相对较小。划痕实验及迁移相关蛋白检测发现AX-I-3可能不是通过抑制A549细胞的迁移来发挥抗肿瘤作用。流式细胞检测结果显示,AX-I-3组分主要将A549细胞阻滞在细胞周期的G1期,并且可以促进细胞凋亡。qRT-PCR结果显示,AX-I-3能够明显促进人肺腺癌A549细胞中P53、Bax、Cyt-C及Caspase-3mRNA的表达,抑制Bcl-2 mRNA的表达。Western blot对凋亡蛋白进行测定,发现AX-I-3能够增加P53,Bax、Cyt-C和Caspase-3蛋白的表达量,降低Bcl-2的表达量,活性多糖AX-I-3可能是通过线粒体途径诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。2、研究发现阿拉伯木聚糖AX-I-3对Lewis肺癌小鼠的生活状况有所改善,对Lewis肺癌小鼠移植瘤具有一定的抑制作用,石蜡切片染色也表明AX-I-3抑制了肿瘤细胞的生长。ELISA结果表明AX-I-3可提高Lewis肺癌小鼠的血清中细胞因子IL-2、IL-6和TNF-α水平,并且与减半剂量DDP联用效果更好,增强机体免疫功能。脾脏T淋巴细胞检测结果提示AX-I-3可能通过提高CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的比例来改善小鼠细胞免疫功能。Western blot实验结果发现AX-I-3可能通过降低Bcl-2蛋白表达量,增加P53,Bax,Cyt-C和Caspase-3蛋白的表达量来引起肿瘤细胞发生凋亡。3、采用酶解法和酸解法将多糖降解为寡糖,通过HPTLC筛选出最佳降解条件为0.2 mol/L TFA,80℃下水解3 h。对该条件下降解的寡糖进行重复性和稳定性评价结果显示酸水解法具有良好的重复性和稳定性。对不同分子量寡糖进行单糖组成分析和质谱分析,结果显示OS-2可能由木糖和葡萄糖通过1,4糖苷键连接,OS-3~OS-7可能通过阿拉伯糖和木糖通过1,4糖苷键连接。MTT法检测结果表明寡糖OS-3、OS-5和OS-6对人肺腺癌A549细胞增殖具有明显的抑制作用,OS-3抑制作用效果较好。流式细胞术检测结果显示,OS-3主要将A549细胞阻滞在细胞周期的G1期,并且可以促进细胞凋亡。qRT-PCR结果显示,OS-3能够明显促进人肺腺癌A549细胞中P53、Bax、Cyt-C及Caspase-3 mRNA的表达,抑制Bcl-2 mRNA的表达。Western blot对凋亡蛋白进行测定,发现OS-3能够增加P53,Bax、Cyt-C和Caspase-3蛋白的表达量,降低Bcl-2的表达量,OS-3可能是通过线粒体途径诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。结论:本课题采用MTT法对黄芪药渣中四种不同种类阿拉伯木聚糖进行抗肿瘤活性筛选,发现AX-I-3组分多糖对A549细胞具有一定的增殖抑制作用;对活性阿拉伯木聚糖AX-I-3进行体外和体内抗肿瘤作用研究,发现AX-I-3的抗肿瘤作用机理可能与机体免疫力的增强和线粒体凋亡途径的激活相关;体内实验还发现AX-I-3与减半剂量的DDP联合给药使得抗肿瘤效果增强,且DDP的毒副作用降低。对活性阿拉伯木聚糖AX-I-3降解得到的寡糖进行了结构的初步解析和抗肿瘤活性筛选,进一步对活性寡糖OS-3进行了体外抗肿瘤作用研究,其机制与细胞凋亡有关。该研究对开发黄芪药渣的高附加值产品,建立可循环产业链,实现生态资源良性循环可持续利用具有重要意义。