火腿葡萄球菌产支链氨基酸转氨酶条件优化及支链氨基酸代谢研究

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本文研究了来源于火腿的5株葡萄球菌的支链氨基酸转氨酶(Branched-chain amino acid aminotransferase, BCAT)活性、产酶条件及反应体系,测定了BCAT引导下的支链氨基酸代谢途径中支链酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶和酯酶活力以及风味物质,为研究火腿葡萄球菌BCAT酶学性质及其引导的支链氨基酸代谢提供理论依据。研究结果如下:从火腿中筛选得到5株产支链氨基酸转氨酶的优良葡萄球菌,测定了这些菌株生长曲线和]BCAT活力,并以L-亮氨酸为作用底物,对生长快、酶活力高的腐生葡萄球菌RG-2进行了产酶条件优化,通过单因素和响应曲面试验得到优化条件为:pH7.09、温度M.87℃、NaCl浓度为2.21%,在此条件下BCAT活力为38.59±1.58U/mL。羟基乙醇和谷胱甘肽对BCAT活力有促进作用,盐酸羟胺、EDTA及Zn2+、Cu2+等部分金属离子对酶活有抑制作用(浓度均为1mM)。通过单因素和正交试验得到腐生葡萄球菌RG-2的最优反应体系为:反应温度37℃、pH8.5、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)浓度为4mmM、5‘-磷酸吡哆醛(5’-Pyridoxal phosphate. PLP)浓度为0.06mM,在此条件下RG-2的BCAT活力达到42.69±1.34U/mL。分析了5株葡萄球菌BCAT引导下的支链氨基酸代谢途径中支链酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶和酯酶的活力,结果表明:5株葡萄球菌均有支链酮酸脱羧酶活力,其中以腐生葡萄球菌RG-2的酶活最高,达到36.05±3.42U/mL,木糖葡萄球菌X-6的乙醇脱氢酶活力显著高于其它菌株(P<0.05),达到88.97±2.91U/mL,腐生葡萄球菌RG-2的酯酶活力显著高于其它菌株(P<0.05),达到126.67±2.60U/mg蛋白。以L-亮氨酸为底物,在5株葡萄球菌的菌液反应体系检测到产物3-甲基丁醇,其中以RG-2菌液反应体系生成的3-甲基丁醇含量显著高于其它4株葡萄球菌(p<0.05),达到0.088±0.035mM;在菌株培养前,加入3-甲基丁醛显著增加3-甲基丁醇的生成量。同时添加三种支链氨基酸(L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸)于酶活反应体系时,只测得亮氨酸的代谢产物3-甲基丁醇,而三种支链氨基酸底物分别添加时,均可测得相应的醇代谢产物;三种支链氨基酸醇代谢产物的生成量与BCAT底物特异性实验结果存在差异。支链氨基酸代谢产物影响条件的实验结果显示,3-甲基丁醇转化率在6-72h范围内随时间延长而增大,但差异不显著(P>0.05),且3-甲基丁醇转化率分别在培养温度45。C、培养pH6.4、培养基NaCl浓度2.5%时取得最大值。
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