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研究目的对小鼠胃粘成纤维细胞(Mouse gastric mucosa fibroblast,MGMF)进行原代分离培养,并构建其体外活化模型,以模拟体内胃癌相关成纤维细胞的活化,在此基础之上探索长链非编码RNA-H19基因(Long non-coding RNA-H19,lncRNA-H19)与胃癌相关成纤维细胞(Gastric cancer-associated fibroblast,GCAF)活化的相关性。研究方法用组织块法对小鼠(C57BL/6小鼠)的胃粘膜成纤维细胞进行原代分离培养。成功培养后,在光学显微镜下对其形态学特征进行鉴定,同时辅以免疫荧光染色鉴定细胞内波形丝蛋白(Vimentin)、结蛋白(Desmin)的表达的表达情况,以进一步确认其细胞来源并分析纯度;在成功对小鼠胃粘成纤维细胞进行分离培养后,利用与小鼠胃癌细胞(MFC)共培养加上间隙性缺氧处理的方法构建GCAF的体外活化模型,以模拟胃癌微环境中GCAF的活化过程。建模后,利用ELISA法对细胞培养液中重要的活化效应分子进行检测,利用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)分别对活化相关蛋白mRNA进行检测,同时利用CCK-8法、Transwell迁移实验及流式细胞技术分别对GCAF体外活化模型进行细胞增殖、迁移及凋亡实验,并用CCK-8法检测MGMF、GCAF分别与MFC共培养后MFC的增殖活力变化,以验证GCAF体外活化模型构建是否成功;在成功建模的基础上,利用qPCR方法对比分析MGMF及GCAF中lncRNA-H19基因的表达情况,以验证lncRNA-H19与GCAF的活化有相关性。同时,我们进一步利用siRNA干扰基因表达的方法,对GCAF中的lncRNA-H19基因进行干扰沉默,随后用ELISA法检测干扰后相关活化因子的表达情况,利用CCK-8法、Transwell侵袭实验及流式细胞技术分别对干扰表达后的GCAF进行细胞增殖、侵袭及凋亡实验,以进一步证实lncRNA-H19与GCAF的活化有明确相关性。均值的比较采用独立样本t检验或方差分析。研究结果光学显微镜下见所分离的细胞呈梭状或两头尖的长条状,大小较均一,呈贴壁放射状生长,符合成纤维细胞的形态特征。免疫荧光染色技术鉴定结果显示波形丝蛋白(Vimentin)表达阳性,而结蛋白(Desmin)表达阴性,符合成纤维细胞的蛋白表达特征;活化模型建立后,GCAF培养液中重要活化效应分子IL-6、TGF-β1、HGF及CXCL12表达量均较MGMF明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。同时,GCAF细胞内的α-SMA、FAP相关mRNA的相对表达量也均明显高于MGMF(P<0.05)。另外,细胞功能实验显示,GCAF的增殖活性及迁移能力较MGMF明显增强,而细胞凋亡明显降低,且GCAF能明显促进MFC的增殖,差异有统计学意义(P<0.05);qPCR法对细胞内的lncRNA-H19表达情况检测显示,GCAF的表达量较MGMF显著上调(2.10±0.14 VS.1.00±0.09,P<0.001)。而lncRNA-H19干扰表达后,GCAF培养液中前述重要活化效应分子的表达量显著下降(P<0.05),同时细胞的增殖活性及侵袭能力也显著降低,而细胞凋亡率则显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。研究结论LncRNA-H19与GCAF的活化具有明显的相关性,抑制LncRNA-H19的表达可以抑制GCAF的增殖与侵袭,并促进其凋亡,这提示LncRNA-H19有可能成为胃癌的临床治疗的一个新靶点。因此进一步对LncRNA-H19参与GCAF活化的具体机制研究十分必要。