褶纹冠蚌(Cristaria plicata)是我国主要的淡水育珠蚌之一,随着集约化养殖的发展和环境恶化,由病原体,化学物质引起的各种疾病频繁发生于褶纹冠蚌的养殖群体中。过氧化物还原酶(Peroxiredoxin)是一个新发现的抗氧化酶家族,能够维持细胞内的氧化还原平衡通过消除细胞内的过氧化氢和烷基过氧化氢。本对褶纹冠蚌的1-Cys Prx和2-Cys型Prx基因进行研究,以期阐明这两类抗氧化蛋白在褶纹冠蚌免疫统中的作用机制,为蚌类抗病机理研究提供理论依据。1.褶纹冠蚌1-Cys过氧化物还原酶的克隆及表达研究褶纹冠蚌Prx6 (CpPrx6)基因的cDNA序列全长1617 bp;其中5’端不翻译区为7l bp,3’端不翻译区为889 bp,开放阅读框为657 bp,可以编码218个氨基酸。CpPrx6的预测分子量为24.24 kDa,理论等电点为6.33。同源性分析显示CpPrx6含有1-Cys Prx共有的保守GPX催化中心"PVCTTE"和脂肪酶基序"GKSW"。CpPrx6二级结构包含6个α螺旋、12个β折叠。经序列比对和系统发育树分析表明褶纹冠蚌与南极帽贝(Hyriopsis cumingii)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)、皱纹盘鲍(Haliotis discus discus)的1-Cys过氧化物还原酶基因具有非常高的同源性。RT-PCR检测显示,CpPrx6基因在血细胞、外套膜、闭壳肌、肝脏、鳃等组织中均有表达,其中以鳃组织表达最强,显著高于其他组织。嗜水气单胞菌刺激后在肝脏中12h内CpPrx6基因的表达量不断上升,24 h时恢复到正常水平。在刺激后6 h时,实验组和对照组之间具有显著性差异。12 h时达到极显著。将CpPrx6进行体外重组并在大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中实现表达。利用SDS-PAGE分析表达产物,发现经IPTG诱导的实验组较空白对照菌在40KDa处增加了一条明显的蛋白条带。说明CpPrx6基因在PET原核表达系统能够得到表达。2.褶纹冠蚌2-Cys过氧化物还原酶的克隆及表达研究褶纹冠蚌TPx基因的cDNA序列全长1247bp;其中5’端UTR为90 bp,3’端UTR为566 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF) 591 bp,可以编码196个氨基酸。CpTPx含有2-Cys Prx都含有含有保守F-motif "FTFVCPTEI"和高度保守的输水区域"VCPAGW",并且也含有真核生物典型2-Cys Prx的特征序列"GGLG",由此可以得出结论：CpTPx属于典型2-Cys Prx。CpTPx二级结构包含5个α螺旋、7个p折叠,间隔有2段无规则卷曲。系统进化树显示,褶纹冠蚌TPx与其他物种的Prxl聚为一支。因此我们将CpTPx归为Prxl亚家族中。RT-PCR检测显示,CpTPx基因在血细胞、外套膜、闭壳肌、肝脏、鳃等组织中均有表达,其中以肝脏和鳃组织表达最强,显著高于其他组织。嗜水气单胞菌刺激后在肝脏中24 h内,CpTPx基因的表达量高于对照组,在刺激后6h时和24 h,实验组和对照组之间具有显著性差异。12h时达到极显著。将CpTPx进行体外重组并在大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中实现表达。利用SDS-PAGE分析表达产物,发现经IPTG诱导的实验组较空白对照菌在37KDa处增加了一条明显的蛋白条带。说明CpTPx基因在PET原核表达系统能够得到表达。体外抗氧化实验证明,当H202浓度在0-0.8 mM时,含pET-32a(+)-CpTPx的大肠杆菌对H202有拮抗作。