疟疾是严重威胁人类健康的一种传染病,主要通过按蚊叮咬吸血传播。蚊媒防治是阻断疟疾传播和控制疟疾流行的重要策略。化学杀虫剂作为当前蚊虫防治的主要措施,可导致环境污染和滞留,对人畜有害,而且蚊对化学杀虫剂的耐药性也越来越强。近年来,苏云金杆菌和球形芽孢杆菌等生物杀虫剂在蚊虫防治中的应用受到了越来越多的关注。生物杀虫剂因其对靶向生物的特异性而对人畜无害,易降解而不会对环境造成污染滞留。然而,目前生物杀虫剂的应用尚缺乏较好的应用基础研究,导致剂量选择盲目,使用不规范。不规范的应用,往往导致亚致死剂量的效果,这将加快蚊对生物杀虫剂耐药性的产生。因此,明确生物杀虫剂的杀虫效果和合理使用剂量,对于其推广应用非常重要。此外,亚致死剂量的生物杀虫剂往往导致部分按蚊存活,在人为选择的压力下和接触生物杀虫剂后存活按蚊天然免疫状态、肠道微环境等可能发生变化,存活按蚊对疟疾的传播能力会否因此而改变及其改变机制,目前尚无相关报道。而按蚊传疟能力的改变将直接影响疟疾的传播和流行。本课题首先通过生物测定的方法探讨了生物杀虫剂对按蚊的杀伤效果和合理剂量,然后研究了经过亚致死量生物杀虫剂处理后按蚊传疟能力的改变,继而探讨了天然免疫机制在生物杀虫剂对按蚊传疟能力影响中的作用,为生物杀虫剂规范施用中的剂量选择提供参考,也为生物杀虫剂推广应用的后续风险提供理论依据,为通过蚊虫控制阻断疟疾传播提供新思路。本课题共分以下三个部分:第一部分,生物杀虫剂Bti对斯氏按蚊幼虫杀伤效果检测本研究利用国际上标准的Probit analysis生物测定方法,首先用不同梯度浓度的生物杀虫剂Bti处理斯氏按蚊四龄幼虫,于施药后不同时间点计算幼虫的累计死亡率,通过线性回归分析获得相关公式,计算半致死浓度LC50和LC95等重要参数,探讨Bti对斯氏按蚊的杀伤效果和使用剂量。然后利用半致死浓度的Bti处理不同密度的斯氏按蚊幼虫,分析按蚊幼虫密度对Bti杀伤效果的影响。结果显示,Bti对斯氏按蚊四龄幼虫的杀伤作用起效快,在施药后12h各组即有明显幼虫死亡,累计死亡率在12h后随作用时间延长持续增高。在用药后同一时间点上,各组间累计死亡率随Bti浓度的升高而增大。Bti的浓度对数值与累计死亡率P值呈较好的线性关系,根据所获得的公式计算出Bti作用12、24、48和72h后,半数致死浓度(LC50)分别为(1242±60)IU/L、(1112±45)IU/L、(1010±73)IU/L、(855±32)IU/L,95%致死浓度(LC95)分别为(4170±138)IU/L、(3746±444)IU/L、(3462±409)IU/L、(3080±464)IU/L。而且随着幼虫密度的增加,其累计死亡率显著降低。第二部分,生物杀虫剂对按蚊传疟能力的影响。利用易感动物模型(约氏疟原虫-斯氏按蚊)和不易感动物模型(约氏疟原虫-大劣按蚊)分别检测了生物杀虫剂Bs对按蚊传疟能力的影响。将斯氏按蚊和大劣按蚊各分为正常对照组和Bs处理组。在疟原虫感染后9天,观察蚊胃基底膜约氏疟原虫卵囊的数量和黑化情况,比较疟原虫的感染率和感染度以及黑化情况。结果显示,Bs处理后约氏疟原虫对斯氏按蚊和大劣按蚊的易感性均显著下降。Bs处理组大劣按蚊与正常对照组相比,黑化度与黑化率无明显差异,提示黑化机制未参与Bs对按蚊传疟能力的影响。第三部分,天然免疫机制在生物杀虫剂对按蚊传疟能力影响中的作用研究。运用Real time PCR和半定量PCR法分别比较分析了斯氏按蚊和大劣按蚊对照组和Bs处理组间关键抗疟基因TEP1的转录水平。结果显示,斯氏按蚊多个蚊期在Bs处理后TEP1转录水平均有上调,尤其在疟原虫感染后的24小时显著上调;大劣按蚊幼虫、蛹和成蚊的TEP1转录水平在Bs处理组均高于空白对照组。结论:1.生物杀虫剂Bti株对斯氏按蚊幼虫的杀伤效果好,作用强、起效快,是一种较为理想的杀虫剂。在实际应用中,应充分考虑蚊虫种群密度,密度高则需酌情增加剂量。本研究为Bti在斯氏按蚊幼虫的控制中的合理剂量选择,提供了重要参考。2.亚致死剂量的生物杀虫剂Bs处理,可明显降低斯氏按蚊和大劣按蚊对约氏疟原虫的传疟能力。3.Bs通过影响按蚊关键抗疟分子TEP1基因的转录水平(而不是黑化机制),改变按蚊的天然免疫状态,从而影响按蚊的传疟能力。