杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella spicicida)之前又称迟缓爱德华氏菌,是海水养殖业的重要致病菌,可感染牙鲆、大菱鲆和罗非鱼等多种重要经济水产动物,严重影响了我国海水养殖业的健康发展。截止到目前,有关杀鱼爱德华氏菌的致病机制还尚未完全了解。铁是杀鱼爱德华氏菌引发宿主致病所不可或缺的,然而,在宿主体内大部分铁以血红素的形式存在,自由铁很少,因此,利用血红素释放铁的血红素摄取系统在杀鱼爱德华氏菌引发宿主致病过程中扮演着至关重要的作用。在前期对杀鱼爱德华氏菌组学研究中发现,一个注释为血红素利用蛋白的基因很可能参与了细菌的抗逆性和致病性。为了进一步探究和明确该基因的功能,本研究以杀鱼爱德华氏菌血红素利用蛋白HutZEp为对象,通过对HutZEp的功能检测及其受铁吸收调控因子(Ferric uptake regulator,Fur)的调控作用分析,阐述HutZEp在杀鱼爱德华氏菌抗逆和致病过程中的作用及其受调控机制,为杀鱼爱德华氏菌的防治提供理论支撑。主要研究内容和结果如下:(1)HutZEp蛋白结构功能分析。生物信息学分析表明HutZEp是一个与血红素利用相关的蛋白,它与大肠杆菌血红素还原酶ChuY的同源性最高(50.23%)。hutZEp与它上游的两个血红素利用相关基因hut WEp和hutXEp为共转录关系,三者共同形成一个操纵子hutWXZEp。通过血红素结合试验及蛋白质酶活性检测试验分析了 HutZEp的蛋白功能,发现HutZEp不能够与血红素结合,也不能够利用NADPH和NADH作为电子供体还原FMN。基于此,我们推测HutZEp不是杀鱼爱德华氏菌血红素利用所必需的。(2)hutZEp在杀鱼爱德华氏菌抗逆性和致病性中的作用分析。利用基因敲除技术构建了无标记的hutZEp框内突变菌株TX01ΔhutZ。逆境检测实验表明hutZEp的缺失并不会影响杀鱼爱德华氏菌在正常环境下、缺铁环境下以及在缺铁环境中补充血红素条件下的生长,但是能够显著减弱细菌的生物膜形成能力和运动能力;RT-qPCR分析表明hutZEp的缺失并不会影响已知与生物膜形成相关基因的表达,这表明hutZEp很可能是杀鱼爱德华氏菌一个新的生物膜形成因子:与野生株TX01相比,TX01ΔhutZ对酸胁迫的耐受性以及抗宿主血清杀菌能力均明显降低。致病性分析表明hutZEp的缺失显著降低了杀鱼爱德华氏菌对宿主细胞粘附和胞内繁殖能力,显著降低了对宿主组织的侵染能力;与野生株TX01相反,突变株TX01ΔhutZ在阻止宿主巨噬细胞激活方面存在明显缺陷。突变株TX01AhutZ的回补菌株TX01ΔhutZC在细菌的抗逆和致病能力方面与野生株TX01相当。因此,hutZEp不仅是杀鱼爱德华氏菌重要的毒力因子,也可能是杀鱼爱德华氏菌新的生物膜形成因子,在细菌抗逆性和致病性过程中扮演着至关重要的作用。(3)hutZEp受调控机制的研究。预测了hutZEp启动子,利用PCR获取hutZEp启动子p283序列,将其与报告载体pSC11相连获得重组质粒pSZ283,转化至大肠杆菌DH5α感受态,通过X-Gal平板检测发现p283具有启动子活性。将pSZ283分别与表达载体pT3和fur过表达载体pTFur共转至DH5α感受态细胞中,得到重组菌株DH5α/pSZ283-pT和DH5α/pSZ283-pTFur。通过启动子活性检测发现DH5α/pSZ283-pT的β-半乳糖苷酶酶活力值是DH5α/pSZ283-pTFur的95倍,表明Fur对hutZEp启动子p283具有强烈的抑制作用;为进一步明确Fur对启动子p283的作用,体外表达纯化了 Fur蛋白,凝胶迟缓实验(EMSA)发现,Fur蛋白能够与hutZEp启动子p283结合。RT-qPCR检测结果表明hutZEp在fur敲除株TX01Δfur中的表达量是野生株TX01的145倍;Western blot分析表明HutZEp在TX01 Δfur菌株中的表达量显著高于在TX01中的表达量。这些结果充分表明,hutZEp受Fur蛋白的直接负调控。综上研究表明,杀鱼爱德华氏菌HutZEp可能是一个新的生物膜形成因子,在杀鱼爱德华氏菌生物膜形成过程中起着重要的作用;同时,HutZEp不仅在抗酸性等逆境环境中发挥着作用,而且还参与了抗血清杀菌作用,在病原菌侵染宿主细胞和组织过程中发挥着重要作用。此外,本研究还发现,虽然HutZEp不是细菌血红素利用所必需的,但hutZEp的表达受铁吸收调控因子Fur的直接负调控。本实验首次在杀鱼爱德华氏菌中阐述了 HutZEp的功能与受调控机制,从一个新的切入点来研究杀鱼爱德华氏菌的致病机制,并为杀鱼爱德华氏菌的防治提供新的思路。