【摘 要】
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目的:构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6-CFP21(CE21)融合蛋白的重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,通过IFN-γ的检测探讨CE21在结核病检测中的价值。方法:通过聚合酶链式
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目的:构建结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6-CFP21(CE21)融合蛋白的重组质粒,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白,通过IFN-γ的检测探讨CE21在结核病检测中的价值。方法:通过聚合酶链式反应(PCR)扩增获得编码CFP21和CFP10-EAST-6(CE)的基因片段,分别连接到pMD18-T克隆载体,并将两片段两次连接到表达载体pET21a(+)中,最终获得pET21a(+)-CFP10-ESAT-6-CFP21重组质粒;优化表达条件,亲和层析方法纯化得到重组蛋白,经复性及去除内毒素后,将其作为T淋巴细胞刺激抗原,利用酶联免疫吸附试验检测重组抗原刺激后,48例结核病患者、30例非结核肺部疾病患者及32例健康对照者全血中IFN-γ的释放水平。结果:成功克隆了编码CFP21和CE的基因,构建了表达质粒pET21a(+)-CFP10-ESAT-6-CFP21, IPTG诱导在大肠杆菌中得到高水平表达CE21蛋白包涵体,经SDS-PAGE分析后分子量为41kDa,与预期大小一致。纯化得到高纯度的CE21蛋白,复性后测得蛋白含量为2.42mg/mL。CE21融合蛋白全血标本IFN-γ的检测,结核组阳性率为72.92%,非结核疾病对照组和健康对照组阳性率分别为3.33%和3.13%。结论:成功在大肠杆菌中获得结核分枝杆菌CE21融合蛋白。体外IFN-γ的检测证明该融合抗原具有良好的结核病检测价值。
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