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本研究采用同源克隆和染色体步移的策略首次分离、克隆了5396 bp的花鲈MSTN基因组序列。花鲈MSTN基因具有3个外显子,2个内含子,整个开放阅读框编码着374个氨基酸,具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点。通过RT-PCR分析表明MSTN基因在花鲈肌肉、脑、眼睛中表达量最高,其次是小肠,鳃、脾脏、肝脏和心脏中只有极少量表达;在早期的胚胎发育中,直到孵化后15天的仔鱼才检测到MSTN的表达;在不同细胞系中,MSTN在花鲈胚胎干细胞(LJES1)中表达,但在其它几个花鲈体细胞系(上皮、成纤维、淋巴样细胞)中都没有检测到表达。此外,我们用1125 bp MSTN的5’启动子区域与GFP基因连接,构建了pMSTN-GFP质粒。将pMSTN-GFP转化LJES1细胞,获得了表达;通过显微注射,将pMSTN-GFP质粒转入斑马鱼1细胞期的胚胎,在孵化后10天左右的仔鱼躯干部检测到了绿色荧光的表达。为了提高外源基因转化胚胎干细胞的效率,通过三种脂质体分别介导花鲈胚胎干细胞(LJES1)转化效率的比较,建立了一种简单而有效的基因转移方法。优化了影响外源基因转化效率的因素,如细胞接种时间、初始接种密度、DNA和脂质体用量以及它们之间的比例等。以GFP为报告基因,用Genejammer介导LJES1细胞的基因转移,转化效率最高可达27.3%。经过药物筛选,建立了表达GFP基因的阳性克隆细胞株,经PCR检测证实了GFP基因已经整合到LJES1细胞的基因组中,并获得了正常表达。通过体外诱导,GFP阳性细胞能够分化为肌肉细胞、成纤维细胞、神经细胞等。进一步通过悬滴法培养,GFP阳性细胞形成了拟胚体,证实了经过长期的药物筛选后,LJES1细胞仍然保持着发育的多能性。根据克隆的MSTN基因序列,用长PCR方法扩增了3.2kb和1.5kb同源片段。3.2kb的长同源臂包括MSTN基因的5’区域、外显子1、内含子1、外显子2、内含子2和部分的外显子3;1.5kb的短同源臂包括MSTN基因的部分外显子3和3’区域。质粒骨架为细菌克隆载体pBluescript II KS,neo基因为正选择基因,tk基因为负选择基因。neo基因被插入到长、短同源臂之间,tk基因插入到长同源臂外侧。通过正