研究背景和目的:感音神经性耳聋是耳鼻喉科常见疾病之一,据第39届世界卫生大会资料表明全球共有聋人及听力损伤者达四亿两千万人,各种因素如病毒、细菌感染、噪音、耳毒性药物等均可导致感音神经性耳聋,研究证实其病理变化主要是耳蜗毛细胞及其与其相连的螺旋神经节神经元的缺失,因此如果能够找到某种方法修复缺失的毛细胞或螺旋神经节神经元,就有希望治愈感音神经性耳聋。细胞移植是未来治疗感音神经性耳聋的方法之一,在其他医学领域,已经从临床和实验上证实移植干细胞可以治疗某种疾病,如移植神经干细胞可以治疗帕金森氏病,移植心肌干细胞可以治疗心肌梗死等,近年来研究发现哺乳动物如鼠内耳前庭器官和耳蜗也存在干细胞或高增殖细胞,体外能分化成为毛细胞样细胞及神经元,为干细胞移植治疗感音神经性聋带来了希望,此外,日本学者将大鼠神经干细胞移植入用氨基酸甙类抗生素或噪音致聋的鼠耳蜗,观察到神经干细胞在耳蜗内存活,可以分化为少量的毛细胞及神经元。也有学者发观将神经干细胞移植入耳蜗能改善耳蜗缺血导致的听力下降,这些研究成果表明,移植干细胞是治疗感音神经性耳聋的希望途径,由于内耳干细胞或神经干细胞存在于内耳或中枢神经系统,未来临床应用中取材困难,影响其使用价值,所以必须找一个取材方便、并且能够分化为内耳毛细胞的干细胞来源。本课题拟从SD大鼠中提取骨髓间充质干细胞(MSCs),并将其与耳蜗Corti氏器进行共培养,探讨骨髓间充质干细胞在体外培养的条件下,是否能够分化为内耳毛细胞,为将来利用MSCs移植治疗感音神经性耳聋的临床应用提供理论依据。研究内容和方法:1.骨髓间充质干细胞的纯化和鉴定:采用贴壁法分离、培养、纯化SD大鼠MSCs,在倒置相差显微镜下观察细胞形态,数量的变化,同时对培养的细胞进行CD29、CD34、CD45、CD90、CD117免疫细胞化学鉴定,收集第四代MSCs用于共培养实验。2.耳蜗Corti氏器细胞的分离。取生后1-3天内的SD大鼠乳鼠20只,断头处死,无菌条件下,取出耳蜗,在解剖显微镜下,去除螺旋韧带和蜗轴,得到Corti氏器。再加入2ml 0.25%胰蛋白酶(含EDTA 1mmol/L)置入37℃孵箱8min进行消化,中止消化并离心后弃去上清液,接种于细胞培养瓶中培养。3.分化细胞的基因表达分析:分两组:空白对照组及共培养组。空白对照组是指取第四代MSCs,按(5×104cells/ml)密度接种于6孔板,不与耳蜗Corti氏器细胞共培养,滴加有EGF/bFGF/IGF-1以及N2和B27的DMEM/F12(1:1)无血清培养液,隔日换液一次,连续14天,再收集培养细胞。共培养组是指取第四代MSCs,按上述培养条件,与耳蜗Corti氏器细胞共培养14天,再收集分化细胞,将收集的两组细胞分别提取总RNA,用于RT-PCR鉴定。4.分化细胞的免疫细胞化学鉴定:用毛细胞的标志物(Myosin7A、Math1、Calretinin)对分化细胞进行免疫细胞化学鉴定。结果:1.培养第四代的MSCs为均一的“纺锤形”,呈漩涡样生长,细胞荧光化学染色为CD29(+)、CD90(+)、CD117(+)、CD34(-)CD45(-),符合大鼠MSCs的特征。2. MSCs与耳蜗Corti氏器细胞共培养2周后行免疫细胞化学鉴定示分化细胞能表达毛细胞的特异性标志物Myosin7A、Math1、Calretinin,其中Myosin7A是目前认为特异性比较高的毛细胞标志物,Math1在毛细胞形成早期即有表达一直到成熟期,Calretinin为前庭毛细胞早期特异性分子标志物。3.空白对照组未见毛细胞标志物mRNA的表达。共培养组可见在Marker为500bp、750bp的电泳条带之间,出现扩增片段长度为624bp的Myosin7A电泳条带以及扩增片段长度为545bp的Math1电泳条带。结论:1.体外已成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为具有内耳毛细胞分子特征的毛细胞样细胞。2.耳蜗Corti氏器细胞可能分泌多种调节因子,诱导骨髓间充质干细胞向毛细胞分化。