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第一部分胆管癌差异性microRNA的筛选及验证目的：筛选胆管癌及对应癌旁组织中差异表达的microRNA,并扩大样本量进行验证,初步判断目标microRNA在胆管癌组织中的表达情况,为下一步实验选择研究对象。方法：采用MicroArray及表达谱芯片分析3对胆管癌及对应癌旁组织中microRNA及mRNA的差异性表达,并对其进行GO功能分析及pathway通路分析,分析在胆管癌发生发展过程中可能涉及的位点及通路；通过实时定量PCR及Northern blot对扩大样本量的14对胆管癌及对应癌旁组织的micro RNA-200b/c表达水平进行验证。结果：1.胆管癌组织差异性表达microRNA21条,其中过表达15条、低表达6条。GO分析及Pathway分析显示microRNA-200家族在胆管癌中可能发挥重大影响。2. microRNA-200b/c/429在14对胆管癌组织中相对应癌旁组织呈明显的低表达,其中,microRNA-200b (p=0.038)和]microRNA-200c (p=0.019)的低表达差异具有统计学意义。3. microRNA-200b/c在12对胆管癌组织中验证,呈明确低表达。结论：1. microRNA-200b/c/429功能簇在胆管癌中呈显著的低表达,其中microRNA-200b/c总体表达水平具有统计学意义,可作为下一步研究对象。2. Rho/ROCK及细胞骨架通路在胆管癌中具有显著差异,可作为后续机制研究参考。第二部分miR-200b/c对胆管癌侵袭转移及耐药特性的影响研究目的：验证miR-200b/c在体内体外对胆管癌侵袭、转移及化疗敏感性的影响方法：1.利用外源性化学合成miR-200b/c mimics/antagomir载体转染人胆管癌细胞TFK-1、 QBC939。转染后利用Transwell实验、划痕实验及CCK-8检测对胆管癌体外的侵袭转移及对5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响。2.利用慢病毒载体miR-200b/c-U、miR-200b/c-D转染人胆管癌细胞系TFK-1,并构建裸鼠胆管癌脾脏转移模型,利用MRI小鼠成像及肝脏病理切片检测其对胆管癌体内远处转移能力的影响。结果：1.上调miR-200b/c表达可显著降低胆管癌细胞系TFK-1、QBC939的体外侵袭、迁移能力,下调miR-200b/c表达可增加其侵袭、迁移能力。相对于阴性对照组,实验组结果均有统计学意义(P≤0.01)。2.上调]miR-200b/c表达可增加胆管癌细胞系TFK-1对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性,其24h、48h及72h实验组IC50值较阴性对照组差异均具有统计学意义(P<0.01)。3.上调]miR-200b/c表达可减少胆管癌细胞系TFK-1在裸鼠胆管癌肝脏转移模型中肝脏微转移灶的形成,下调miR-200b/c表达可增加其远处转移灶的形成。相对于阴性对照组,实验组结果具有统计学意义。结论：1. miR-200b/c可增加胆管癌细胞系TFK-1对5-氟尿嘧啶的化疗敏感性,可降低其体外侵袭、迁移能力2. miR-200b/c可减少裸鼠体内胆管癌模型中肝脏远处微转移灶的形成。第三部分miR-200b/c对胆管癌干细胞特性的影响研究目的：验证miR-200b/c在体内体外对胆管癌皮下成瘤、克隆球形成、分化及干细胞表面标志物的影响方法：1.对慢病毒载体干预后的胆管癌细胞TFK-1进行裸鼠皮下成瘤实验,明确其对胆管癌细胞成瘤能力的影响。2.利用克隆球形成实验对慢病毒载体干预后的胆管癌细胞TFK-1进行检测,并利用分化实验检测其内源性miR-200b/c的表达水平变化。3.利用流式细胞术对外源性miR-200b/c干预后的TFK-1细胞进行干细胞表面标志物的检测,明确其对胆管癌干细胞比例的影响。结果：1.外源性miR-200b/c可降低TFK-1皮下成瘤能力,抑制miR-200b/c表达可增加其成瘤能力。相对于阴性对照组,实验组的差异具有统计学意义(P≤0.01)。2.外源性miR-200b/c可降低TFK-1克隆球形成能力,抑制miR-200b/c表达可增加其成球能力。内源性miR-200b/c表达水平与分化程度呈负相关。相对于阴性对照组,实验组的差异具有统计学意义(P≤0.01)。3.外源性miR-200b/c可降低TFK-1表面CD133表达水平,但对CD24、CD44表达水平无影响。抑制miR-200b/c表达可增加其表达。相对于阴性对照组,实验组的差异具有统计学意义(尸≤0.01)。结论：1. miR-200b/c可影响TFK-1细胞皮下成瘤、克隆球形成能力,TFK-1细胞内源性miR-200b/c表达水平与分化程度呈负相关。2. miR-200b/c可影响TFK-1细胞表面CD133表达率,但对CD24、CD44表达率无影响。第四部分]miR-200b/c对胆管癌侵袭转移及干细胞特性的调节作用位点及其机制研究目的：验证miR-200b/c对胆管癌侵袭转移及干细胞特性影响的作用靶点及其上下游通路；阐明miR-200b/c作用靶基因的生物学功能方法：1. TargetScan预测miR-200b/c在胆管癌中可能的靶基因；利用Western blot检测转染后预测靶基因的蛋白水平的表达变化。2.利用Western blot及免疫组织化学法检测预测靶基因在胆管癌及癌旁组织中的表达情况。3.构建双荧光素酶报告基因,验证miR-200b/c与靶基因的结合情况。4.利用小干扰RNA对靶基因进行功能学上的验证。结果：1.确定并验证SUZ12、ROCK2是miR-200b/c的靶基因,miR-200b/c可直接结合于SUZ12、ROCK2的3’非翻译区,抑制其蛋白质水平的的合成。2. SUZ12、ROCK2的蛋白水平在胆管癌组织呈明显低表达,基因水平的表达无明显的差异性。3. miR-200b/c通过抑制ROCK2,进而影响其下游LIMK-Cofilin通路影响胆管癌的侵袭转移。4. miR-200b/c通过SUZ12影响胆管癌干细胞特性。结论：1. miR-200b/c可直接作用于SUZ12、ROCK2发挥效应。2. miR-200b/c-ROCK2-LIMK-Cofilin通路对胆管癌侵袭转移的影响与经典的EMT途径即ZEB1/2-E-Cadherin通路具有协同性。3. miR-200b/c-SUZ12对胆管癌干细胞特性具有调节作用。