整合蛋白(integrin)是一类重要的细胞表面粘附分子,可以调节许多基本的细胞功能,例如细胞增殖、分化和凋亡等。一般情况下,整合蛋白通过控制细胞与细胞外基质粘附,促进细胞增殖或抑制细胞凋亡。但是在一些实体肿瘤,例如肝癌中,整合蛋白表达水平通常较低。而且越来越多的实验证据显示,整合蛋白可能参与细胞周期的抑制性调节,但机制尚未明确。我们已有的研究结果发现,在肝癌细胞株SMMC-7721中,整合蛋白α5β1过表达可以抑制细胞增殖并降低此细胞株在裸鼠中的成瘤性。整合蛋白β1亚基过表达可抑制SMMC-7721细胞增殖,并诱导细胞周期阻滞。通过进一步研究发现,此细胞周期阻滞现象与细胞周期抑制性调控蛋白p21和p27的表达密切相关。p27的mRNA表达不变,而其蛋白质表达增加,其已证明与p27蛋白质的降解减少有关;p21的mRNA和蛋白质表达均上调,进而发现整合蛋白β1亚基过表达可以增强p21启动子的活性,然而其具体机制不甚明了。因此本研究旨在深入探讨整合蛋白调控p21基因的机制,以进一步揭示整合蛋白对细胞增殖抑制性调控的分子机制。本课题所使用的细胞株主要为我们实验室以前构建的稳定转染整合蛋白β1亚基的人肝癌细胞株SMMC-7721细胞(β1-7721细胞)以及对照株Mock-7721细胞。首先,为了研究整合蛋白β1亚基过表达所诱导的细胞周期阻滞以及增殖抑制是否与p21的蛋白水平升高有关,我们构建了p21的siRNA表达质粒pSi-p21。我们发现当p21表达下调后,整合蛋白β1亚基过表达引起的增殖抑制效应明显减轻,细胞增殖速度加快,但与野生型SMMC-7721相比仍然略低,这说明整合蛋白β1亚基过表达所导致的细胞增殖抑制并不是全部由于p21表达升高引起的;同时流式细胞分析发现细胞周期处在S期的细胞明显减少。这些说明p21在整合蛋白β1亚基过表达所导致的细胞周期S期阻滞和增殖抑制中有着重要的作用。一般来说,p21蛋白水平主要由两方面因素调控,一是p21蛋白的稳定性调节,二是p21的转录水平的调控。我们利用放线菌酮处理Mock-7721和β1-7721细胞后检测p21的稳定性,发现在两株细胞中p21的半衰期没有明显差异,因此整合蛋白β1亚基过表达主要在转录水平上调p21的表达。在利用荧光素酶报道基因表达系统检测β1整合蛋白过表达对p21基因启动子的活性影响时,我们发现整合蛋白β1亚基过表达主要增强了p21基因的近侧启动子的活性。由于该区域不含p53结合位点的,同时β1整合蛋白过表达对p53的表达量并没有明显影响。因此,整合蛋白β1亚基过表达是通过p53非依赖途径诱导p21基因的表达。p21近侧启动子区域含有6个位置接近的转录因子Sp1的结合位点,根据文献报道,这些Sp1位点与多种p21基因p53非依赖途径激活有关。我们构建了p21近侧启动子区域的荧光素酶报道基因载体pGL3-217的一系列Sp1结合位点的突变体,用于转染Mock-7721和β1-7721细胞。结果发现p21基因近侧启动子上第3个Sp1位点(-82～-77)的突变后完全阻断了整合蛋白β1亚基过表达所诱导的p21启动子活性增高。为了进一步证实转录因子Sp1在整合蛋白β1亚基过表达诱导p21基因表达过程中的作用,我们用染色质免疫沉淀的方法检测两株细胞中p21近侧启动子上转录因子Sp1的结合情况。结果发现整合蛋白β1亚基过表达可使p21启动子上结合有更多的Sp1,而对录因子Sp1的蛋白水平并没有影响,因此整合蛋白β1亚基过表达可能通过某些机制促进了Sp1与p21基因区域的结合。通过进一步的研究我们发现,整合蛋白β1亚基稳定过表达后p21基因区域包括启动子和部分内含子外显子的组蛋白H3乙酰化水平有明显增高,而这种整合蛋白所介导的组蛋白的修饰是依赖于组蛋白乙酰转移酶p300的活性的。为了探讨整合蛋白β1亚基过表达是通过何种上游信号通路影响核内Sp1和p300所介导的p21转录激活,我们首先在Mock-7721和β1-7721细胞中检测了整合蛋白相关信号通路中信号分子的表达情况。结果发现整合蛋白β1亚基过表达可以抑制PI3K/PKB的活性以及下调JNK通路下游分子c-Jun的蛋白水平,然而c-Jun的磷酸化水平却有所升高。通过研究我们发现PI3K/PKB信号通路的抑制在整合蛋白β1亚基过表达诱导p21基因表达过程中没有明显作用;整合蛋白β1亚基过表达主要通过上调c-Jun的磷酸化水平诱导p21基因的表达。在进一步的研究中我们发现磷酸化c-Jun可以直接结合转录因子Sp1而促进p21基因的转录。成熟的整合蛋白分子不是单体,整合蛋白β1亚基需要与相应的α亚基结合成为二聚体才能定位在细胞膜上发挥其生物学功能。我们发现整合蛋白β1亚基过表达可以在不同组织来源的肿瘤细胞中诱导不同类型的α亚基表达,所诱导的α亚基基本上都是该细胞原有表达的类型。而在整合蛋白β1亚基过表达后形成的整合蛋白异二聚体中,整合蛋白α5β1二聚体的增多在整合蛋白β1亚基过表达引起的细胞周期阻滞和增殖抑制过程中起重要作用。因为当整合蛋白α5亚基的表达被下调后,整合蛋白β1亚基过表达不能引起明显的增殖抑制和细胞周期阻滞,也无法上调p21和p27的表达水平。同时我们也发现,当β1-7721细胞在纤连蛋白(FN)平板上培养时,整合蛋白β1亚基过表达引起的细胞周期阻滞和p21、p27表达水平升高被逆转。因此整合蛋白配体的相对缺乏可能是整合蛋白β1亚基过表达引起细胞增殖抑制和细胞周期阻滞的重要原因。