目的:心肌缺血再灌注损伤是导致临床病人发生心肌梗死后血运重建不良后果的主要原因且不可避免,这一结局严重影响到心梗患者的康复及预后,目前在临床也没有特效药物来治疗该类患者。为了减少缺血再灌注的继发损伤,明确其调控机制及找到靶向药物,本研究旨在阐明调控心肌缺血再灌注损伤的关键因子ALOX12的作用机制及评估其靶向抑制物ML355的效果,为临床转化提供一定的理论支持。方法:1.为了探究ALOX12在心肌缺血再灌注损伤中的调控作用,应用免疫印迹技术及共聚焦技术,检测ALOX12在经缺复氧处理的原代大鼠心肌细胞中蛋白表达变化情况。2.构建心脏特异性ALOX12转基因小鼠,并给予冠状动脉结扎术建立心肌缺血再灌注动物模型,使用小动物超声探测仪评价心功能改变;通过活体和解剖取材将心脏组织用于2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、苏木精-伊红(H&E)、苦味酸-天狼猩红(PSR)等病理染色评价心肌细胞梗死面积及心肌纤维化程度;利用RNA-seq筛选病程中心功能、炎症及细胞死亡相关事件因子改变,对下一步机制研究做基础;综合评价ALOX12对心肌缺血再灌注过程中的作用。3.使用体外原代大鼠心肌细胞转染相应的腺病毒载体来干扰或过表达ALOX12,运用缺复氧方式刺激心肌细胞损伤,通过免疫印迹技术鉴定及验证相关蛋白表达情况;运用RNA-seq检测炎症及细胞死亡相关事件因子表达情况。进而在离体实验验证ALOX12在心肌缺血再灌注中的作用。4.通过生物信息学方法找到相关信号通路,从而找到ALOX 12介导心肌损伤的可能机制,并通过免疫印迹及RNA-seq方法验证其调控机制。5.不同分组小鼠给予ALOX12的靶向抑制剂ML355,通过心功能超声及病理检测等方法验证其对心肌缺血再灌注过程中心肌损伤的保护作用。结果:1.ALOX12在经缺复氧处理的原代心肌细胞中蛋白表达水平显著上调。2.心脏特异性ALOX12转基因显著加重了心肌缺血再灌注的损伤程度,心功能相关指标均及病理染色结果均显示心脏特异性ALOX12转基因小鼠心肌损伤、炎症和纤维化程度较非转基因小鼠严重。3.干扰内源性ALOX12的表达显著减轻了体外缺复氧诱导的原代心肌细胞的损伤,炎症及细胞死亡相关因子表达均较对照组低。4.生物信息学结果及免疫印迹结果显示ALOX12通过抑制AMPK的磷酸化激活而加重心肌缺血再灌注损伤。5.ALOX12的靶向抑制剂ML355可以显著改善缺血再灌注诱导的小鼠心功能损伤及心肌坏死。结论:通过本研究的系统研究表明,ALOX12显著加重了心肌缺血再灌注损伤的发生发展,是血运重建后心肌缺血再灌注损伤的关键调控蛋白。经进一步的RNAseq及生物信息学研究分析发现,ALOX12可以通过抑制AMPK的磷酸化激活进而加重心功能及心肌损伤。ALOX12抑制剂ML355明显改善小鼠缺血再灌注引起的心功能紊乱及心肌损伤。以上研究结果不仅加深拓展了我们对心肌缺血再灌注损伤的内在机制认识,也提示ALOX12是治疗血运重建后心肌缺血再灌注损伤的潜在靶点,对于临床转化及进一步的临床推广具有重大意义。