研究背景与目的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国常见的恶性肿瘤之一,占全国恶性肿瘤死亡的2.81%。据WHO估算,中国NPC发病占全世界80%以上,其中又以中国南方地区发病率为最高,如广东、广西、湖南等省,特别是广东珠江三角洲和西江流域发病率最高,高发区发病率15～30/10万人口,死亡率18.46/10万人口。在治疗上,目前以放射治疗为主,放射治疗后鼻咽癌的平均5年生存率为50%-60%。但鼻咽癌早期症状并不明显,70%患者确诊时已属晚期,而晚期鼻咽癌(Ⅲ、Ⅳ)的5年生存率更低,约10%-40%,治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。作为一种剂量依赖型肿瘤,治疗过程中通过提高局部放射剂量可提高鼻咽癌的局部控制率及生存率,但由于接受放射治疗患者会出现放射反应,特别是急性放射反应,明显影响了患者的生活质量和放射治疗的进程,给患者造成极大的损害和痛苦。因此,寻找有效的放射增敏药物对于预防放射副反应具有重要意义。目前常用的放射增敏剂有5-氟尿嘧啶和顺铂,其在杀死肿瘤细胞的同时也对正常的组织细胞产生了毒性作用,从而限制了其在临床上的应用。为了提高鼻咽癌患者的总的生存率,寻找一种安全低毒的放射增敏药物并阐明其增敏机制,具有重要的临床价值和科学意义。姜黄素(Curcumin, Cur)是从姜科姜黄属植物中提取的一种多酚类化合物,临床前研究以及Ⅰ期临床研究表明姜黄素具有广泛的药理活性：具有抗细胞增殖、抗肿瘤血管生成等作用,可以调节机体的抗药性和耐辐射性,促进伤口愈合,并对糖尿病、阿尔茨海默病、帕金森病、心血管疾病、肺部疾病以及关节病有显著的治疗效果。既往研究表明,姜黄素既具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,同时也具有肿瘤放射增敏效应,但姜黄素对鼻咽癌的增敏作用及其机制尚不清楚。鉴于此,本课题拟对姜黄素的放射增敏作用及其机制进行研究。国内外研究证实多药耐药基因1(multidrug resistance gene1, MDRl)与放射敏感性密切相关。宋鹏等证实照射使体外培养的肿瘤细胞的MDR1mRNA表达增强,并对放疗也产生了耐受,表明过表达MDR1使细胞获得放射抵抗性。MDRl的表达受多种因素调控,而microRNA靶向参与MDR1表达调控的研究未见报道。前期研究中,我们证实microRNA可调控MDR1表达。因此,本项目通过体内和体外实验,在证实姜黄素对鼻咽癌是否具有放射增敏作用的基础上,进一步研究MDR1等相关蛋白的表达,探讨microRNA靶向调控MDR1及其参与鼻咽癌放射增敏的可能性。长链非编码RNA (IncRNA)是指转录本长度大于200nt (nucleotide)且不翻译成蛋白质的功能性RNA分子。IncRNA能够影响特定基因座编码的靶蛋白的表达,调节蛋白结合因子的活性,引导染色质修饰复合物的定位以发挥其作用,并且能够通过转录后加工产生大量具有5’帽子结构的小RNA。近年来研究表明,IncRNA与许多癌症的发生和发展密切相关,如膀胱癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等。前期研究中我们发现给予姜黄素处理后,部分IncRNA的表达发生变化。那么在鼻咽癌中,是否有IncRNA的参与及其作用机制,是我们本研究中拟解决的问题。研究内容与方法1.姜黄素对人鼻咽癌CNE-2细胞增殖的抑制作用采用体外培养的人鼻咽癌CNE-2细胞,以MTT法检测姜黄素对CNE-2细胞的细胞毒作用。将不同浓度的姜黄素分别加入到CNE-2细胞培养液,其终浓度分别为5,10,20,40μM,并设立溶剂对照组。加药后分别培养24h和48h,检测吸光度(OD值),并根据存活分数计算出半数抑制浓度。2.克隆形成实验检测姜黄素对CNE-2细胞放射增敏作用实验分为照射组和照射+姜黄素组,胰酶消化细胞后制成单细胞悬液,逐级稀释后以适当密度接种于6孔板中,完全培养液中培养10-14天,待形成明显的细胞集落时甲醇固定30min, PBS清洗后姬姆萨染色10min,显微镜下计算含50个细胞以上的克隆数,根据公式得出存活分数,分别按单击-多靶模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线,计算放射生物学参数Do、Dq、α、β比较姜黄素对CNE-2细胞的增敏作用。3.流式细胞术分析CNE-2细胞周期采用流式细胞术研究姜黄素对CNE-2细胞周期的影响,实验时分成4组：即对照组,照射组,姜黄素组,照射+姜黄素组(10μM),给予处理后,培养24h后PI溶液染色,流式细胞仪检测细胞周期各时相的变化,证实姜黄素或辐射(IR)是否会引起CNE-2细胞的G2期阻滞。4.人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤模型的建立采用细胞悬液法造模,造模成功后按肿瘤体积大小将雄性裸鼠随机分成5组,每组6只：模型对照组(生理盐水)、姜黄素组(100mg/kg)、照射组(4Gy)、照射联合姜黄素组低剂量组(100mg/kg)和高剂量(125mg/kg)组,观察肿瘤的生长情况,并绘制裸鼠移植瘤的生长曲线。5.荧光定量PCR检测MDRl和miR-593基因表达分别提取CNE-2细胞和裸鼠肿瘤组织内总RNA,逆转录成cDNA后用引物进行PCR扩增,荧光定量PCR (quantitative PCR, qPCR)检测组织和细胞中MDRl和miR-593的表达。以2-ΔΔCt值表示基因相对表达强度。6. Western blot检测MDR1蛋白表达提取肿瘤组织中总蛋白、BCA蛋白定量法检测总蛋白浓度后按照SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、显影和定影的步骤进行Western blot检测。7.双荧光素酶报告基因检测系统进行荧光素酶活性分析转染前一天,将293FT细胞(2x105)接种到24孔板中,每孔加入500gL无抗生素的培养基,待细胞融合度达到95%时进行转染,转染48h后收集裂解细胞并检测双荧光素酶活性,以Firefly luciferase与Renilla luciferase的活性比值作为双荧光素酶的相对活性8. IncRNA基因芯片结果分析基因芯片技术筛选上调或下调2倍以上差异IncRNA,挑选出AK294004等6个差异明显IncRNA, qPCR技术验证结果。9.AK294004与CCND1的调控关系研究生物信息学技术预测AK294004的靶基因,过表达实验,siRNA和双荧光素酶报告系统验证AK294004与CCND1的结合位点。结果1.不同浓度的姜黄素作用人鼻咽癌CNE-2细胞,在24h、48h时均呈浓度依赖性。其24h、48h半数抑制浓度(IC50)分别为：.32.006μmol/L,11.854μmol/L。2.克隆形成实验结果表明姜黄素降低了受照射后的CNE-2细胞的克隆形成率。据存活分数拟合细胞存活曲线计算出的表示放射敏感性的指标Do、Dq、SF2均提示姜黄素素提高了放射敏感性。放射增敏比(SER)按单击-多靶模型计算为1.33。3.流式细胞检测细胞周期的结果显示照射导致了CNE-2细胞的G2/M期阻滞(P<0.05)。给予10μM Cur处理24h,G1期细胞比例显著减少p<0.05),G2细胞比例仪轻微增加,姜黄素与IR联合作用时,与对照组相比,G2期细胞比例显著增加,S期细胞比例显著减少(p<0.05)。4.人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤模型实验结果表明：对照组、照射组、姜黄素组(100mg/kg体重)及照射联合姜黄素低剂量组(100mg/kg体重)及高剂量组(125mg/kg体重)的瘤重分别为(0.83±0.17)g、(0.75±0.23)g、(0.55±0.27)g、(0.47±0.11)g和(0.53±0.23)g,组间差异均有统计学意义(P<0.05)。各组移植瘤的体积随时间均呈增大变化,对照组的增长幅度最大,以对照组为参照,药物组、照射组及姜黄素联合照射组(100mg/kg)抑瘤率分别为33.73%、9.63%和43.37%,差异有统计学意义(P<0.05)。5.qPCR结果表明,细胞和组织中,照射组MDR1mRNA表达均显著增高,而照射联合姜黄素组MDRl表达显著下降(t=2.918,P=0.019；t=2.682；P=0.028)。而miR-593的表达与其相反,即照射组miR-593表达明显下降,而照射联合姜黄素组miR-593表达显著上调(t=2.918,P=0.019；t=-2.863,P=0.021)。6. Western blot结果表明,与对照组相比,照射组MDR1表达显著增高(P<0.05).而照射联合低剂量姜黄素组与MDR1表达显著下降,表明姜黄素可逆转照射后MDR1的表达(P<0.05)。7. pGL3-MDR13’UTR和miR-593共转染可显著降低荧光素酶的活性(P<0.01),而将该重组质粒与miR-593inhibitor共转染后可显著增强荧光素酶的活性(P<0.01)。表明miR-593与MDR13’UTR可特异性结合。8.共筛选出在照射和照射联合姜黄素后CNE-2细胞中含量差异显著、且明显上调或下调的蛋白编码基因2480条、1ncRNA基因2795条。qPCR证实AK294004等6个1ncRNA的差异表达与基因芯片结果一致。9.过表达实验中,与对照组(pCDNA3-NC)相比,AK204004的表达增加了3.16倍(t=-13.477,P<0.001),CCND1的表达下降了46%(t=-12.499,P<0.001);RNA干扰实验中,与对照组(siRNA-NC)相比,siRNA-2干扰后,AK294004的表达下降了67%；siRNA-1干扰后,AK294004的表达下降了75%,同时CCND1的表达分别增加了1.34倍和1.48倍,实验结果表明AK294004靶向CCND13’UTR。进一步确认AK294004与CCND13’UTR的结合位点,我们通过荧光素酶报告系统进行了验证,在pGL3-W或pGL3-E1载体中,与pcDNA3-NC相比,pcDNA3-AK荧光素酶活性显著下降(t=8.600,P=0.001;t:4.753,P=0.009);而在pGL3-vector或pGL3-E2载体中,与pcDNA3-NC相比,pcDNA3-AK荧光素酶活性没有显著性差异(t=1.817.P=0.143;t=1.298,P=0.264),表明AK294004的外显子1与CCND13’UTR结合靶向调控CCND1。结论1.通过克隆形成实验及人鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤模型,证实姜黄素在体内外对鼻咽癌有放射增敏作用。2.通过Western blotting,RT-PCR证实姜黄素能逆转MDR1、miR-593的表达,双荧光素酶报告系统明确miR-593靶向MDR13’UTR。证实姜黄素靶向调控593逆转MDR1表达而实现放射增敏。3.通过基因芯片技术筛选出AK294004的等6个差异表达的lnc RNA,过表达实验和siRNA技术、双荧光素酶报告系统证实AK294004靶向CCND1,证实姜黄素靶向调控AK294004逆转CCND1表达而实现放射增敏。