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寨卡病毒(zikavirus,ZIKV)是由伊蚊传播的黄病毒属病毒,孕妇感染寨卡病毒后,可造成新生儿小头症。已有研究证实ZIKV感染为格林巴利综合征的病因之一;由于与我国接壤的越南等国爆发了 ZIKV疫情,因此我国面临潜在的输入性风险。由于病毒样颗粒(virus-likeparticle,VLP)与病毒粒子结构相似,而且不含病毒遗传物质,具有强免疫原性,能诱导机体产生高滴度抗体,是最为安全有效的疫苗研发策略。本研究选择毕赤酵母表达系统表达重组ZIKV囊膜蛋白(Env),纯化重组蛋白后,体外组装VLP,动物实验评价了 VLP疫苗免疫保护效力。目的:本研究以ZIKV囊膜蛋白(Env)为研究对象,通过毕赤酵母表达系统获得重组ZIKV囊膜蛋白,体外组装成VLP,通过小鼠感染模型,进行免疫保护实验,验证VLP疫苗侯选株保护力,为开发以VLP为基础,安全高效的ZKIV疫苗奠定前期研发基础。方法:(1)构建重组表达质粒,利用毕赤酵母表达系统表达ZIKV囊膜蛋白,通过不同浓度zeocin抗生素,筛选高拷贝菌株。(2)诱导表达并纯化目的蛋白,首先采用镍离子金属鳌合层析柱对重组目的蛋白进行初步纯化,然后通过分子筛层析进一步的纯化,通过免疫印迹(Western Blot)和质谱检验目的蛋白是否成功表达。(3)根据不同离子强度和pH值的VLP组装缓冲液,筛选出VLP体外组装的最优条件,通过动态光散射仪和透射电子显微镜鉴定VLP组装效果。(4)将获得的高纯度ZIKVVLP免疫小鼠,酶联免疫吸附测定(ELISA)和细胞中和实验检测小鼠体内诱导的抗体滴度变化,确认其体液免疫水平,酶联免疫斑点检测(ELISPOT)检测记忆性淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-4细胞因子;胞内细胞因子染色,鉴定记忆性CD8+T和CD4+T细胞分泌INF-γ和IL-4能力,评价其细胞免疫水平,建立小鼠感染模型,攻毒实验验证ZIKV VLP疫苗侯选株对小鼠的保护力。结果:(1)构建了重组表达质粒,经测序验证表明重组质粒构建正确。(2)通过Western Blot和蛋白质谱检测,证明了 ZIKVEnv获得成功表达。(3)通过动态光散射仪和透射电子显微镜鉴定组装效果,证明了组装后的VLP呈球状,与天然ZIKV粒子大小基本一致,ZIKVVLP体外组装成功。(4)蚀斑减少中和试验(PRNT)证明了 ZIKV VLP能够诱导生成高滴度的中和抗体,ELISPOT和胞内细胞因子染色分析,证明了可诱导机体产生强细胞免疫反应。(5)小鼠动物攻毒保护实验,证明了 ZIKVVLP能够使免疫缺陷小鼠(A129)获得致死剂量病毒攻击的完全保护。结论:利用毕赤酵母表达系统成功表达ZIKVEnv,并在体外成功组装了 VLP,免疫小鼠能实现完全保护,本研究获得的ZIKVVLP疫苗侯选株有望开发为一种安全高效的ZIKV疫苗。另外,还研究了可在15 min内检测埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)快速检测技术,将标记胶体碳颗粒的兔多抗喷涂于玻璃纤维素膜上制备碳标垫,以1 mg/mL的EBOV-VP40单克隆抗体(McAb,4B7F9)和羊抗兔IgG,按2 μL/cm的包被量印迹于硝酸纤维膜上,分别作为检测线与质控线,组装试纸条。该试纸条能够特异的检测EBOV重组VP40蛋白、EBOV病毒样颗粒(EBOV-VLP)和灭活EBOV,而与马尔堡病毒样颗粒(MARV-VLP)、流感病毒A/PR/8(IAV/PR/8)、黄热病毒(YFV-17D)、登革热病毒2型(DEN2)无交叉反应,显示良好的特异性。本研究建立的EBOV胶体碳免疫层析试纸条能够快速、高灵敏、特异地检测EBOV,为现场快速筛查EBOV感染提供一种新方法。