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目的检测TMP和联合As2O3后对HL-60细胞增殖、分化的影响，并探讨其分子机制。建立SCID小鼠-人AML模型，体内验证TMP减毒增效功能，并探讨其机制。方法1.TMP抑制HL-60细胞增殖和诱导分化的作用。MTT法检测TMP对HL-60细胞增殖影响；NBT还原能力实验检测TMP作用下HL-60细胞向粒系分化时功能成熟程度，并筛选出TMP最佳诱导分化浓度；瑞氏染色观察细胞形态学变化；流式细胞仪检测细胞表面分化抗原CD11b、CD14表达率；流式细胞仪检测HL-60细胞周期分布；RT-PCR、Western blot检测细胞周期相关mRNA和蛋白：c-myc、p27、CDK2和cyclinE1表达。2. TMP联合As2O3对HL-60细胞增殖的影响。采用HL-60和ECV-304两种细胞株，分为空白对照组、TMP组、As2O3组、TMP联合As2O3组。MTT法检测HL-60细胞增殖变化；RT-PCR测定HL-60细胞VEGF mRNA表达；ELISA检测HL-60细胞分泌VEGF蛋白的差异。台盼蓝染色计数绘制ECV-304细胞生长曲线；流式细胞仪检测ECV-304细胞早期凋亡率；倒置显微镜观察ECV-304细胞贴壁情况。3.TMP联合As2O3对HL-60细胞诱导分化的作用。分组同前。MTT实验检测HL-60细胞增殖变化；瑞氏染色观察细胞形态学变化；NBT还原能力实验检测HL-60细胞向粒系分化时功能成熟程度；流式细胞仪检测HL-60细胞表面分化抗原CD11b、CD14表达率；流式细胞仪检测细胞周期分布；用RT-PCR、Western blot检测c-myc、p27、CDK2和cyclinE1mRNA和蛋白表达。4.建立SCID小鼠-人AML模型，对TMP减毒增敏功能进行体内实验验证。建模：在给予SCID小鼠300cGy (60Co source)放射24h内，尾静脉注射HL-60细胞（1×106个）建立模型。免疫组织化学检测小鼠骨髓单个核细胞CD33蛋白表达阳性率和HE染色观察白血病细胞侵润组织情况共同来鉴定建模是否成功。分组：建模后的小鼠随机分为4组：患病组（不予药物治疗）、单用TMP组（200mg/kg TMP腹腔注射，Qd×21天）、单用As2O3组（3mg/kg As2O3腹腔注射，Qd×21天）、TMP联合As2O3组（200mg/kg TMP腹腔注射+3mg/kg As2O3腹腔注射，Qd×21天）。各组小鼠濒死前麻醉后处死。取小鼠血清，检测肝肾功能；ELISA检测血清中VEGF蛋白分泌量；免疫荧光检测小鼠骨髓微小血管密度；免疫组织化学检测小鼠骨髓单个核细胞CD33、HIF-1α蛋白表达。结果1.随着药物浓度的增加，TMP对HL-60细胞的生长的抑制作用逐渐增强；在低浓度（200-300μg/ml） TMP作用下NBT阳性细胞率明显升高。300μg/ml TMP处理HL-60细胞不同时间后，CD11b阳性表达率升高呈时间依赖性（p＜0.01），CD14阳性表达率无统计学差异；细胞被阻滞于G0/G1期；c-myc mRNA和蛋白表达水平明显下调（p＜0.01），p27mRNA和蛋白表达水平显著上升（p＜0.01），cyclinE1和CDK2mRAN水平变化无统计学意义，但其蛋白表达水平则显著下降（p＜0.01），呈时间依赖性。2.在TMP+As2O3组HL-60细胞生长抑制率与空白对照组或单用As2O3组相比显著升高（p＜0.05），HL-60细胞VEGF mRNA和蛋白表达在联合处理后明显减少。在TMP+As2O3组ECV-304细胞早期凋亡率与空白对照组或单用As2O3组相比显著升高（p＜0.01）；经TMP和As2O3单独处理后均可抑制ECV-304细胞对培养瓶壁的粘附能力，联合作用后效果明显增强。3.在TMP联合As2O3组HL-60细胞NBT还原率和粒系分化抗原CD11b表达率显著增高（p＜0.01）；油镜下观察到细胞在形态学上亦趋于成熟；p27mRNA和蛋白表达水平都较对照组显著上升（p＜0.05），c-myc mRNA和蛋白表达水平均明显下调（p＜0.01），cyclinE1mRNA表达水平下降（p＜0.05），其蛋白表达水平下降更明显（p＜0.01），CDK2mRAN表达变化轻微，但其蛋白表达水平显著下调（p＜0.01）。4.预处理后SCID小鼠注射HL-60细胞后其骨髓单个核细胞CD33呈强阳性表达，肝、脾、肾、骨髓及转移瘤组织病理切片显示有大量AML白血病细胞浸润，证实SCID小鼠-人AML模型建立成功。各组白血病SCID小鼠生存时间存在显著差异，各治疗组小鼠生命延长率分别是：单用TMP组29.63％，单用As2O3组50％，TMP联合As2O3组74.07％。AST在患病组显著少于As2O3组（p＜0.05）,AST、CREA在联合用药组显著少于As2O3组（p＜0.05）。CD33蛋白在患病组骨髓单个核细胞中表达呈强阳性，在单用As2O3组、单用TMP组呈中度表达，在联合用药组呈低表达。HIF–la蛋白在患病组呈强阳性表达，在单用As2O3组呈中度表达，在单用TMP组呈低表达，联合用药组表达阴性。在联合用药组VEGF蛋白分泌量也较单用药物组和患病组显著降低。患病组白血病SCID小鼠骨髓微血管的血管形态幼稚，血管腔狭小，血管管壁结构紊乱；治疗组白血病SCID小鼠骨髓微血管管腔较对照增大，血管结构较完整。各治疗组小鼠骨髓MVD显著地低于患病组（p＜0.05），联合用药组明显低于其余各组（p＜0.05），单药治疗组之间骨髓MVD计数无差异。结论1.小剂量TMP能诱导HL-60细胞分化，使细胞周期阻滞于G0/G1期，其机制可能是c-myc表达的下调，p27表达的增加，在蛋白水平抑制与cyclin E-CDK2复合物的结合，使细胞周期停滞于G0/G1期。2.TMP联合As2O3后抑制HL-60细胞增殖作用增强。其机制可能是一方面HL-60细胞VEGF mRNA合成和蛋白分泌减少，通过VEGF自分泌途径促进白血病细胞凋亡，通过VEGF旁分泌途径中抑制血管内皮细胞ECV-304的增殖；另一方面抑制内皮细胞ECV-304的增殖与转移，阻断血管新生的重要环节。3.小剂量TMP能增强小剂量As2O3诱导分化的作用，以粒系分化为主。其机制可能是TMP通过上调p27mRNA和蛋白表达，下调c-mycmRNA和蛋白表达，抑制cyclin E-CDK2复合物蛋白激酶活性，阻滞细胞由G1期向S期过渡，促使HL-60细胞分化成熟。4. TMP能增强As2O3对SCID小鼠-人AML模型的治疗作用，明显改善小鼠的肝肾功能。其增效的机制可能是TMP下调白血病模型小鼠体内HIF-1a和VEGF的表达，小鼠骨髓MVD减少，微小血管结构趋向正常化，使AML细胞凋亡率升高。该实验填补了TMP在抗血管生成作用动物模型的空白。