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背景:我国是肝病大国,随着人们生活水平的提高,酒精在生活中的滥用,酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的发病率也迅速增加。在我国,酒精性肝病在饮酒人群中的发病率高达6.18%。近年来,越来越多的研究着眼于micro RNA在酒精性肝病中对脂质代谢、凋亡、炎症等过程的微观调控作用。micro RNA是一类长度为18-24个核苷酸的非编码小RNA,虽然不能编码蛋白质,但是可以通过靶向靶基因m RNA的3’UTR区的碱基对来调控下游基因的表达。已有大量文献报道了mi R-200a在肝纤维化,肝癌中具有重要的调控作用,但其在酒精性肝病中的角色尚未被定义。探讨mi R-200a在酒精性肝病中的作用及其作用机制,是防治酒精性肝病的重要方法之一。E盒锌指结合蛋白(ZEB)1和2在上皮细胞向间质细胞转化分化过程中抑制E-cadherin的表达,诱导上皮间质转化(EMT),EMT的异常激活是肿瘤发生发展的重要因素。ZEB2在细胞凋亡过程中发挥重要作用,但其在酒精性肝病中的作用尚不明确。有研究发现micro RNA200家族与ZEB2有着密切联系。本课题组拟以酒精饲养小鼠模型为研究对象,研究mi R-200a在酒精性肝病中对肝细胞凋亡的调控作用及其可能的作用机制。方法:在体实验:8周大小的C57BL/6雄性小鼠普通饲料喂养一周左右以适应环境,然后按照Gao-Binge模型方法进行为期16天的造模,将全部小鼠分为两组分别以对照饲料和酒精饲料喂养,并与最后一天给予酒精灌胃。灌胃后9h左右对小鼠进行眼球取血,灌流原代肝细胞,提取肝脏组织等操作。采用免疫组化、RT-q PCR和Western Blot方法检测原代肝细胞中mi R-200a和ZEB2的表达变化。慢病毒尾静脉注射抑制mi R-200a,RT-q PCR、Western Blot和TUNEL染色检测mi R-200a对肝细胞凋亡的影响。离体实验:不同浓度乙醇刺激小鼠正常肝细胞AML-12,RT-q PCR和Western Blot方法检测mi R-200a和ZEB2表达情况。然后转染mi R-200a inhibitor和mimics,凋亡流式细胞术,TUNEL染色和Western Blot检测肝细胞凋亡变化。通过计算机模拟分析和萤光素酶报告实验分析得出ZEB2是mi R-200a的可能结合靶点,并通过RT-q PCR和Western Blot检测沉默和过表达mi R-200a后ZEB2的表达变化。最后通过共转染mi R-200a和ZEB2来确定mi R-200a是否是通过ZEB2来发挥作用。结果:在体实验发现酒精饲料喂养小鼠的肝脏中,肝细胞凋亡比例明显增加,且ZEB2的表达量随mi R-200a的沉默而升高。体外AML-12细胞中发现不同浓度乙醇刺激后,mi R-200a表达量呈梯度增加而ZEB2则呈梯度降低。转染mi R-200a inhibitor结果发现凋亡率较对照组明显降低而转染mi R-200a mimics发现凋亡率较对照组明显升高。萤光素酶报告实验发现ZEB2可能存在mi R-200a的结合位点。ZEB2的表达随mi R-200a的沉默而升高,随mi R-200a的过表达而降低.提示了mi R-200a对ZEB2的负调控作用。结论:在酒精肝模型中,mi R-200a表达呈浓度梯度增加而ZEB2表达呈浓度梯度降低。并且mi R-200a的表达增高对肝细胞的凋亡有促进作用而ZEB2的表达降低对肝细胞的凋亡有促进作用。本文研究还提示mi R-200a可能是通过靶向抑制ZEB2来调控肝细胞凋亡进而影响酒精肝进程