论文部分内容阅读
创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是大脑受外力震动、撞击或穿刺后引起的一种神经损伤性疾病,具有高致残率和致死率的特点,目前临床上尚无特效疗法。TBI后会遗留多种并发症,包括运动、认知及交流障碍等,给患者家庭以及整个社会带来了沉重的负担。干细胞移植治疗为解决这一难题带来了希望。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)作为一种来源于新生儿脐带组织的多能干细胞,具有来源广泛、采集方便、增殖分化能力强、免疫原性低、无伦理学争议等特点,是干细胞移植治疗的理想种子细胞。然而,移植后干细胞在病灶处的滞留率低、存活能力差等问题,最终限制了干细胞移植在TBI治疗中的应用。如何解决这些问题,成为提高干细胞移植治疗疗效的重要课题。组织工程是一门新兴学科,旨在使用一种生物相容性好且可被生物体降解吸收的支架材料联合种子细胞进行移植治疗。支架材料能为干细胞提供生长支撑以及适宜的细胞外微环境,从而解决干细胞移植治疗中存在的细胞滞留率低和细胞存活能力差的问题。水凝胶与细胞外基质结构相似,具有良好的生物相容性及可降解性,是最常用的神经支架材料之一。本实验中我们采用壳聚糖(chitosan,CS)、羟乙基纤维素钠(hydroxyethyl cellulose,HEC)、透明质酸(hyaluronic acid,HA)、β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate,GP)构建一种新型的温敏水凝胶CS-HEC-HA/GP,并联合hUC-MSCs,从细胞水平和动物水平上进行系统研究,探讨其生物相容性及其在TBI神经修复中所起的作用,最终为干细胞移植治疗TBI提供新的策略和方法。方法第一部分:水凝胶支架的制备及性能评价溶胶-凝胶法制备CS/GP、CS-HEC/GP及CS-HEC-HA/GP复合水凝胶;凝胶倒置法检测各组水凝胶的胶凝时间;冷冻干燥法测定水凝胶的含水率及降解速率;扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察水凝胶内部微观形貌;旋转流变仪测定水凝胶的弹性模量;流式细胞仪鉴定hUC-MSCs免疫表型;Live/Dead荧光染色检测hUC-MSCs在水凝胶表面和内部的存活、贴附、伸展;激光扫描共聚焦显微镜观察hUC-MSCs在水凝胶内部的三维分布;CCK-8法检测hUC-MSCs在水凝胶内的增殖。第二部分:水凝胶支架联合hUC-MSCs对TBI大鼠神经修复的作用大鼠皮下移植CS-HEC-HA/GP水凝胶,通过质量分析及苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色等方法验证其可注射性、生物可降解性以及生物相容性;采用自由落体打击法构建TBI大鼠模型,将TBI大鼠随机分为生理盐水组(normal saline,NS)、水凝胶支架移植组(scaffold)、单独干细胞移植组(MSC)和联合移植组(scaffold+MSC),并进行移植治疗;神经功能缺损评分(modified neurological severity score,mNSS)评估大鼠运动功能恢复;蔗糖偏好测试检测大鼠抑郁情绪;新事物识别测试评估大鼠认知功能恢复;Morris水迷宫测试评估大鼠学习记忆功能恢复;草酸铵结晶紫(crystal violet,CV)染色观察大鼠脑组织病灶处修复;免疫荧光染色观察大鼠脑组织中hUC-MSCs的存活、迁移以及脑DG区神经元标记物(NeuN)、增殖细胞标记物(Ki67)的表达;qRT-PCR检测大鼠脑组织中NeuN及神经营养因子(BDNF)相关基因的表达;Western Blot检测大鼠脑组织中NeuN、BDNF及细胞凋亡(Bax)相关蛋白的表达。结果第一部分:水凝胶支架的制备及性能评价本实验中制备的壳聚糖复合水凝胶具有良好的温敏特性;各组水凝胶在37℃条件下胶凝时间均小于10 min,且随加入HEC和HA的浓度增加而缩短;各组水凝胶含水率均在90%以上,且随HEC、HA的浓度增加而增加;各组水凝胶在人工脑脊液中均会发生降解,浸泡28天后剩余水凝胶的质量约为原质量的60%~80%,随加入HA浓度的增加而减小;水凝胶内部呈现三维多孔网络结构;各组水凝胶弹性模量随振荡频率增加而增大,弹性模量曲线平滑稳定,除CS/GP水凝胶外,其余各组水凝胶在振荡频率为100 rad/s时弹性模量均保持在100~200 Pa范围内,其数值与HA浓度呈负相关关系;实验中使用的hUC-MSCs符合间充质干细胞鉴定标准;hUC-MSCs可以在6 h内在水凝胶表面贴附并伸展,GP浓度为3%、HA浓度为0.2%的水凝胶生物相容性明显高于其他组(p<0.05);hUC-MSCs在水凝胶内部呈现均匀的三维分布,并能够存活和增殖,GP浓度为3%、HA浓度为0.2%的水凝胶内部细胞生长及增殖状态明显优于其他组(p<0.05)。第二部分:水凝胶支架联合hUC-MSCs对TBI大鼠神经修复的作用CS-HEC-HA/GP水凝胶具有良好的可注射性、生物相容性以及生物可降解性;与对照组(NS组)相比,治疗组(MSC和scaffold+MSC组)大鼠的运动、认知、学习记忆功能及抑郁情况均有显著改善(p<0.05),且联合移植组的改善程度明显优于单独细胞移植组(p<0.05);与单独细胞移植组相比,使用水凝胶支架联合移植可以明显减少病灶处hUC-MSCs的流失,提高其迁移效率;与对照组相比,干细胞移植和干细胞联合水凝胶支架移植均能显著提高大鼠脑内NeuN、BDNF基因及蛋白的表达水平(p<0.05),降低Bax蛋白的表达水平(p<0.05),增加Ki67阳性细胞数,且联合移植组效果明显优于单独细胞移植组。结论1、CS-HEC-HA/GP温敏水凝胶具有良好的生物相容性和生物可降解性,能够为hUC-MSCs生长提供三维立体支撑及适宜的胞外环境;2、CS-HEC-HA/GP水凝胶联合hUC-MSCs移植治疗可以显著提高病灶处干细胞的滞留率,改善TBI大鼠运动、认知、学习记忆功能及抑郁情况,提高大鼠脑内神经营养因子表达水平及神经元细胞活性并减少细胞凋亡,促进TBI后大鼠的神经功能修复。