小反刍兽疫缓释微囊疫苗制备技术研究

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小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的一种重大烈性传染病。2007年首次传入我国西藏地区,对我国畜牧养殖业构成严重威胁。国际上防控小反刍兽疫采取的接种弱毒疫苗措施,存在毒力返强的风险。灭活疫苗虽然安全,但缺点是免疫原性弱,且加入的免疫佐剂(主要为矿物质佐剂和油佐剂)容易引起动物源性食品安全问题。人们可以采用对传统灭活疫苗进行控、缓释作用的微囊化技术解决以上问题。国外已有人用缓释微囊制剂上市,但在兽用缓释微囊疫苗方面的研究刚起步。因此,无论从我国PPR的防控还是动物源性食品安全性的角度,都急需开展PPR缓释微囊疫苗制备技术的研究。本研究以浓缩的灭活PPRV为抗原,利用天然生物可降解型材料—海藻酸钠和壳聚糖,探索了利用内源乳化法和喷雾-复凝聚法两种方法制备动物用缓释微囊疫苗的可行性。采用正交试验,确定了内源乳化法制备灭活PPRV微囊疫苗的较佳工艺:海藻酸钠浓度2%,司盘-85浓度2%,搅拌速度400rpm,水油比例为1:5。在此工艺条件下制备了三批灭活PPRV缓释微囊疫苗,并用建立的性能指标评价体系和评价方法进行了测定。结果表明:三批灭活PPRV微囊疫苗形态和均匀度良好,平均包埋率达到75.1%,冻干前后平均粒径分别为88.5μm和70.1μm,且均呈正态分布,在体外生理盐水中可持续释放18d,具有较好的缓释效果。将三批疫苗分别免疫小鼠30d后,眼球采血分离血清,用间接ELISA方法测定抗体效价。结果显示:三批微囊疫苗免疫的小鼠ELISA抗体效价均达到1:160,而灭活PPRV抗原对照ELISA抗体效价为1:40,表明包埋后灭活PPRV仍具有良好的免疫原性。稳定性试验结果表明:37℃放置6m后的微囊疫苗免疫小鼠,ELISA抗体效价仍为阳性(1:40),仍具有较好的免疫原性。建立了喷雾-复凝聚法制备灭活PPRV微囊疫苗的二艺艺方法,并优化了微囊疫苗固化后溶液的pH值,最终确定pH为7.5。在此工艺条件下制备了三批灭活PPRV微囊疫苗,并用建立的性能指标评价体系和评价方法进行测定,结果表明:三批灭活PPRV微囊疫苗均呈不规则长囊状,平均包埋率为42%,包埋前灭活PPRV病毒捕获ELSIA抗体为1:64,而包埋后灭活PPRV微囊疫苗离心后上清液和微囊离心沉淀超声裂解上清液的捕获ELSIA抗体效价分别为1:32和1:64,说明包埋前后灭活PPRV抗原活性得到较好保持。动物试验结果表明:尽管两批灭活PPRV缓释微囊疫苗免疫组抗体滴度比油佐剂疫苗组免疫抗体滴度偏低,但两种方法制备的灭活PPRV微囊疫苗在免疫绵羊后lm,中和抗体效价均能达到1:20以上,均高于小反刍兽疫弱毒疫苗1:10的质量标准,最高可达到1:90-1:160,且中和抗体滴度至少能持续6m-7m,呈现出良好的缓释效果,是一种具有广阔应用前景的新型疫苗。
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