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实验目的通过各种方法及相关蛋白的测定,探讨人参炔醇对胰腺癌干细胞增殖及自我更新的影响。实验方法(1)胰腺癌干细胞培养:胰腺癌Panc-1细胞在加有EGF、b FGF及B27的干细胞培养体系培养基中培养,参照试剂说明及其他文献培养成胰腺癌干细胞,细胞的CD133+用流式细胞仪进行检测,观察培养后细胞的干性比例;(2)胰腺癌干细胞分选:为了得到更高比例的胰腺癌干细胞,通过流式细胞仪将培养的细胞进行CD133+分选。(3)CCK8实验:将人参炔醇分为0、72、144、287nmol/L四个药物浓度分别作用于胰腺癌干细胞,作用时间为0、12、24、48h,CCK8实验选出合适的药物作用浓度及最佳的作用时间;(4)克隆实验:浓度为0、72、144、287nmol/L的人参炔醇作用于胰腺癌干细胞48h后,将干细胞消化为单个细胞,并重新种于6孔板中培养两周,形成集落后,对实验组与对照组集落的数目进行比较;(5)western blot实验:检测增殖相关蛋白Ki67、PCNA及自我更新有关蛋白β-catenin。实验结果(1)经干细胞培养体系培养的胰腺癌干细胞,用流式细胞仪检测其CD133+比例为9.96%,对照组干性比例为2.21%,两组相比具显著统计学意义(P<0.001);(2)经过细胞分选后,胰腺癌干细胞比例为96.78%,对照组为3.67%,两组相比具有显著统计学意义(P<0.001);(3)CCK8实验OD值检测显示,人参炔醇减少胰腺癌干细胞的存活率,药物作用具有浓度依赖性,并随着时间延长作用加强,0、72、144、287nmol/L的人参炔醇作用胰腺癌干细胞48h后存活率分别为100%、63.13%、50.32%、41.62%,结果具有显著统计学意义(P<0.001);(4)克隆实验中,数量上实验组的集落少于对照组(P<0.001);(5)人参炔醇作用48h后,胰腺癌干细胞的Ki67、PCNA及β-catenin蛋白表达量均降低。结论(1)人参炔醇作用于胰腺癌干细胞,抑制其增殖及自我更新能力;(2)其机制可能与下调Ki67、PCNA表达,阻滞Wnt/β-catenin信号通路有关。