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脑中风(Stroke)是一组以脑缺血或出血型损伤,导致部分脑功能丧失为主要临床表现的疾病。在中国,脑中风已上升为第一死亡原因,发病率排名世界第一,存活者也致残率极高。而在西方发达国家,脑中风是仅次于心脏疾病和癌症,第三大的死亡原因。临床上对脑中风的治疗方法最常用的是溶栓疗法,但是它有严格的时间窗的限制(<3小时),并且可能引发颅内出血等严重并发症,因此应用受到很大的限制。为了能够延长时间窗和降低溶栓后颅内出血的发病率,使更多的患者得到治疗,脑保护剂的研究显得极为迫切。Neuregulin(NRG)是目前为止研究的比较多的一种神经调节蛋白。神经调节蛋白(NRG)是一种细胞之间的信号蛋白。有NRG-1, NRG-2,NRG-3和NRG-4四种亚型,神经调节蛋白1(NRG-1)是目前为止研究的较为透彻的一种亚型。我们的离体实验结果表明神经调节蛋白1(NRG-1)与其受体erbB4结合后,对皮层神经元有显著的神经保护作用。然而神经调节蛋白1(NRG-1)发挥神经保护作用的机制,迄今为止国内外尚无确切的相关报告。阐明这一机制,对于进一步的了解神经调节蛋白在体内的生理作用,为脑卒中的临床治疗提供新的治疗靶点是非常有意义的。本实验室2007年发表的一篇neuron的文章证实在前额叶皮层中GABA能神经元的突触前末梢存在大量的erbB4受体,NRG-1与erbB4受体结合后,可以促进去极化诱导的GABA的释放。我们的实验结果表明GABA受体激动剂对氧-葡萄糖剥夺诱导的皮层神经元死亡有显著的保护作用。那我们的假说是：NRG-1与GABA能神经元表面的erbB4受体结合,可能通过促进GABA的释放,作用于皮层神经元表面的GABA受体,从而发挥神经保护作用。具体的实验如下：首先,用出生一天的SD乳鼠取皮层组织,原代培养皮层神经元,12d神经元成熟后,用免疫组织化学的方法,标记GAD67,计数离体的皮层神经元中GABA神经元的比例。结果显示GABA神经元占约总皮层神经元的20%。其次,将成熟的皮层神经元用于氧-葡萄糖剥夺(OGD)／复氧(R)模型。取培养12天生长良好的皮层神经元,分成两组：control组,将Neurobasal-A Medium换为有糖的EBSS平衡液,放至正常有氧孵箱；OGD/R组,将培养基更换为无糖EBSS平衡液,放至缺氧孵箱。4h后,control组和OGD组均更换为正常Neurobasal-A Medium培养基,24h后,染Hoechst33342/PI,计数PI阳性细胞率,评估细胞死亡情况。结果显示：control组和OGD/R组细胞死亡率分别为5.0478%±3.9862%和30.3178%±1.6481%(两组相比,P<0.01), OGD/R组的神经元死亡率明显高于control组,模型建立成功。在OGD/R模型建立成功的基础上,分别向OGD组给予NRG-1,NRG-1+ecto-erbB4 (ecto-erbB4为人工提纯的erbB4包外段,可中和游离的NRG-1), NRG-1+CGP52432+BMI(CGP52432和BMI分别GABA受体A,B阻断剂),baclofen and muscimol (muscimol和baclofen分别为GABA受体A,B激动剂),NRG-1, baclofen and muscimol。给予1nM,5nM和10nMNRG-1,细胞死亡率分别为18.7073%±1.3083%,14.5508%±1.1598%和16.7418%±1.5110%,(分别与OGD组相比,均为P<0.01),表明NRG-1可以显著降低皮层神经元的死亡率,NRG-1对离体皮层神经元有明显的保护作用。这一结果同Byron D. Ford课题组的在体结果是一致的。erbB4+/+HER4heart(+/+)mice体外培养皮层神经元成熟后,做OGD模型成功后,计数细胞的死亡率为29.5737%±3.1727%,而erbB4-/-HER4heart(-／-)nice的细胞死亡率为50.3186%±2.7868%,两组相比P<0.01,erbB4-/-HER4heart(-/-)mice细胞死亡率明显高于erbB4+/+HER4heart(+／+)mice。因此,认为erbB4全脑敲除的mice与野生型mice相比,对OGD的敏感性增强。给予NRG-l+ecto-erbB4后,神经元的死亡率为25.4851%±2.3788%(与NRG-1组相比P<0.01),可以看出ecto-erbB4可以明显减弱NRG-1的神经保护作用。以上结果表明NRG-1的神经保护作用是通过NRG-1-erbB4途径发挥的。向OGD/R模型分别加入muscimol, baclofen和baclofen+muscimol后,细胞死亡率分别为19.8850%±1.3313%,26.2343±1.1948和19.9551%±0.7647%。(与OGD组相比,均为P<0.01),结果表明GABA受体激动剂同样对离体的皮层神经元有显著的保护作用。那么GABA受体激动剂和NRG-1的神经保护作用有什么样的联系吗?。为了验证这一现象,向OGD/R模型中同时加入NRG-1和GABA受体阻断剂(CGP52432和BMI),细胞死亡率为23.6560%±1.6259%(与NRG-1组相比P<0.01),结果表明GABA受体阻断剂部分阻断了NRG-1的神经保护作用。向OGD/R模型同时加入NRG-1和GABA受体激动剂(muscimol+baclofen),细胞死亡率为13.3528%±1.6691%(与NRG-1组相比P>0.05),结果表明同时给予GABA受体激动剂和NRG-1组与单独给予NRG-1组相比,细胞死亡率无显著性差异,提示NRG-1与GABA受体激动剂的保护作用无协同作用,提示GABA能机制参与了NRG-1的神经保护作用。