研究背景将种子细胞与多孔支架(人工合成或天然)混合后培养是组织工程体外实验的主要模式,再配合特定培养条件使种子细胞向特定方向分化、增殖,可以满足定向组织构建的需求。脂肪干细胞具有取材难度低、增殖活性高、分化方向多、表型表达稳定等特性,是目前组织工程研究比较理想的种子细胞。现阶段,越来越多的学者认识到支架内部空间立体因素对种子细胞增殖、分化存在影响。但由于常用的支架材料大多不透明,如要观察所种植细胞的行为大多需要通过破坏细胞所处微环境方能实现。如果能够在保持细胞及周围微环境相对稳定的情况下进行无干扰的观察、检测,将对解释空间立体因素作用于细胞的机制提供巨大的帮助。随着微尺度技术(Micro-scale technologies)的发展,研究者可以设计、制作微米级甚至纳米级细胞培养平台。其中,微孔阵列(Microwells)实验平台因其具有加工难度低、生物亲和度高、通用性强、设备需求度低等优点,在组织工程领域已获得越来越多的关注。利用这一平台可以实现对所种植细胞几乎无干扰的观察,为高效率研究物理、空间因素对细胞增殖、分化的影响提供了契机。研究目的利用高精度微尺度技术制作出不同孔径的微米级聚二甲基硅氧烷(PDMS)微孔阵列,再将人脂肪干细胞以一定浓度接种于其中,使细胞在不同直径微孔内呈现多种层叠状态(单层、多层)。通过对不同层叠状态下细胞的增殖、凋亡、分化等行为进行检测,一方面验证此实验平台的安全性,另一方面在保持细胞外微环境不被破坏的前提下对细胞的生物学行为进行观察、分析,着重探讨空间立体因素对人脂肪干细胞体外培养中增殖及分化行为的影响。研究方法(1)通用型PDMS微孔阵列微反应器的构建：借助高精度微尺度技术在硅晶元表面制作高度为50μm及直径分别为60μm、80μm、100μm口150μm的微柱状结构,经聚二甲基硅氧烷(PDMS)倒模生成同规格孔径的微孔阵列,加装PDMS环形外壁后组成微反应器。测量、分析此实验平台所生成微孔的误差率,并测试微反应器的密封性。(2)人脂肪干细胞体外培养的增殖、分化特性及鉴定：对成品人脂肪干细胞进行体外培养鉴定,检测第1、3、6代细胞活性,观察其形态变化、生长趋势和活细胞比例,并绘制细胞生长曲线、计算群体倍增时间：检测此三代细胞的表面抗原标记是否存在差异；选取第3代细胞进行成脂、成骨诱导分化,并通过油红O、茜素红染色及成脂分化(PPAR-γ、β-Actin和C/EBPa)、成骨分化(OPN、OCN和AKP)特异性标记物进行鉴定,判断其成脂、成骨分化能力。(3)利用通用型PDMS微孔阵列微反应器研究空间堆叠因素对人脂肪干细胞增殖、凋亡的影响：取第3代人脂肪干细胞配制成3×104/ml、6×104/ml、1×105/ml三种浓度单细胞悬液,分别接种于无微孔PDMS平面微反应器、普通培养皿密闭培养区及具备直径60μm、80μm、 100μm和1501μm微孔的微孔阵列微反应器内,选择种植后24h、72h、120h和168h为采样点,用光学显微镜、扫描电镜观察细胞分布状况并进行形态学描述,再用激光扫描共聚焦显微镜对经荧光染色细胞进行细胞分布、细胞计数及凋亡计数检测,确定能够最终实现可控堆叠模型(单层组、1-2层组、2-3层组)的脂肪干细胞悬液浓度-微孔孔径配比。(4)利用通用型PDMS微孔阵列微反应器研究空间堆叠因素对人脂肪干细胞成脂、成骨分化倾向的影响：在前一实验基础上选择具备80μm、100μm和150μm直径微孔的PDMS微孔阵列微反应器,配制 浓度为6×104/ml的脂肪干细胞单细胞悬液接种于微反应器内,形成三组具备不同堆叠层数(单层组、1-2层堆叠组、2-3层堆叠组)的三维培养实验组,接种后24h开始成脂和成骨诱导,于诱导后14d对微反应器内的细胞进行油红O和茜素红染色,并于诱导后0d、7d、14d将微反应器内的细胞消化后收集,分别对其成脂分化(PPAR-γ、β-Actin和C/EBPa)、成骨分化(OPN、OCN和AKP)特异性标记物进行定量分析,比较各时间点不同堆叠状态对脂肪干细胞分化倾向性的影响。研究结果(1)实验一：成功构建高精度通用型PDMS微孔阵列微反应器,各孔径误差率<±0.2%,微反应器外壁与底面黏着良好无渗漏。(2)实验二：人脂肪干细胞体外培养具有稳定且旺盛的生长能力,增殖能力强且稳定,第1、3、6代细胞活细胞比例并无显著性差异(p=0.108),此三代细胞间群体倍增时间无显著性差异(p=0.104)；细胞表面标记物符合间充质干细胞特征,CD10、CD13、CD29、CD44、 CD59、CD71和CD105呈现高表达,CDllb、CD14、CD18、CD34、CD45、CD56和HLA-DR呈现低表达或无表达,且经多次传代后仍保持比例稳定；经体外成脂、成骨诱导后,细胞经特异性染色鉴定(油红O、茜素红)及特异性标记物表达检测(成脂：PPAR-γ、β-Actin、C/EBPa,成骨：OPN、OCN和AK-P),证实其具有分化为脂肪细胞及成骨细胞的能力,且随培养时间延长表达量显著增高(p<0.01)。(3)实验三：细胞在PDMS平面与普通培养皿表面培养并无明显差异；利用PDMS微孔阵列可以构建满足实验设计需要的细胞堆叠模型,人脂肪干细胞以6×104/ml浓度接种时,可以实现在1501μm直径微孔内呈单层平铺、100μm直径微孔内呈2层堆叠、80μm直径微孔内呈3层堆叠,微孔内细胞数在7d内稳定无显著增减；60μm直径微孔内细胞量最少(p<0.05),且微孔内细胞凋亡比例高于其他各组(p<0.05)；堆叠层数越高,细胞凋亡比例越高。 (4)实验四：处于不同堆叠状态的人脂肪干细胞其分化倾向存在差异,成脂分化倾向以单层组最高、2层堆叠次之、3层堆叠组最低(p<0.05)；成骨分化倾向以2层堆叠最高、3层堆叠次之、单层组最低(p<0.05)；微反应器内特异性分化标记物水平升高晚于纯平面培养。研究结论本研究成功设计并制作出通用型PDMS微孔阵列微反应器,其底板为大量排列整齐、误差率极小的微米级微孔阵列,配合PDMS弹性外壁形成以微孔阵列区为中心的微反应环境。成品人脂肪干细胞具有基本一致的细胞表面标记及免疫特征,不仅具有旺盛、持久的增殖活性,还能保证其细胞表面标记经过多代增殖后不发生显著改变,更能实现体外人工诱导下的成脂、成骨分化,满足实验需求。将此细胞群种植于PDMS微反应器微孔阵列区内,借助微米级平台的结构稳定性,结合对接种密度与微孔设计的调整,构建了可控的细胞立体空间堆叠模型；同时,由于PDMS材质的高透光性,能够实现对微孔内细胞分布、增殖的无创性观察；对微孔内细胞经过成脂、成骨诱导并进行相关分化标记物检测,明确在不同堆叠状态下标记物表达水平。通过本实验,不仅收集了细胞堆叠平台所需的基本数据(细胞接种浓度、微孔直径等),还证实了细胞三维立体培养条件下的凋亡比率、分化倾向性等生物学行为与细胞堆叠层数有关。