一、研究目的和背景近年来,细菌耐药性已成为一个严重的公共卫生危机,它可导致患者治疗的失败、医疗费用的增加和病死率的上升,更为严重的是,细菌耐药性的进一步发展,可能使人类重新面临感染性疾病无药可治的威胁。世界卫生组织（WHO）最近警告说,如果人类不能尽快采取有效行动,细菌耐药性危机将全面来临。目前,几乎所有的抗生素都有相应的细菌产生耐药性,其中,p-内酰胺酶引起的细菌耐药最令人担忧。p-内酰胺酶已经从初始的普通酶演变成为广谱酶、超广谱酶（ESBLs）、碳青霉烯酶等,临床亦发现对所有p-内酰胺类抗菌药物耐药的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等。AmpC酶是一类主要由肠杆菌科细菌、枸橼酸杆菌、铜绿假单胞菌等产生的β-内酰胺酶,它能水解青霉素和第一代、第二代、第三代头孢菌素,以及单环类β-内酰胺类抗生素,且大多引发多重耐药。近年来,随着头孢菌素类及p-内酰胺类抗生素的广泛使用,AmpC酶的临床检出率不断攀升,已成为革兰阴性杆菌产生耐药性的主要原因。AmpC酶的合成与ampC、ampR、ampD、ampE、ampG五种基因有关。其中ampC基因是AmpC酶的结构基因,大多存在于细菌的染色体上,部分也可存在于质粒上,能编码由380个氨基酸组成的、分子量为39.6KDa的AmpC酶。与染色体介导的AmpC酶不同,质粒介导的AmpC酶大多为持续高产型AmpC酶,其产生亦无需抗生素的诱导,并且耐药基因可迅速传播到不同的菌属和菌种,为耐药危机的暴发埋下隐患。目前,AmpC酶的检测方法主要有两类：一是粗提耐药细菌的AmpC酶做药敏试验进行检测,主要有头孢西丁（FOX）敏感试验、AmpC酶表型筛选试验、氟氯西林（FCC）双纸片扩散协同实验、三维试验等；二是对编码AmpC酶的基因进行检测。直接针对AmpC酶进行检查的试验可靠性较高,但一般需要提取酶的粗提物,操作繁琐、比较费时,难以在大多数临床微生物实验室常规应用。AmpC酶的基因检测是利用分子生物学方法测定待检细菌中AmpC酶的基因序列,其结果准确,但需严格防止因污染造成的假阳性或假阴性结果。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是日本学者Notomi等建立的一种新的核酸检测技术。其特点是针对靶基因的6或8个区域设计4或6条特异性引物,利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在等温条件（65℃左右）下保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点,与常规PCR相比,不需模板的热变性、温度循环等过程,也不依赖任何专门的仪器设备,可以实现现场的快速检测。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR术,检测成本远低于荧光定量PCR,适于大规模样品的检测和基层单位推广应用,现已广泛应用于疾病诊断、病原微生物检测以及动物胚胎的性别鉴定等诸多领域。LAMP的反应体系主要包括DNA模板、引物（包括内引物、外引物和环引物）、甜菜碱、dNTPs、Mg2+、Bst DNA聚合酶、Bst buffer等。为了实现LAMP对目的基因的准确检测,须对反应体系进行优化,探索体系中各种成份的最佳浓度,并对灵敏度和特异性进行评估。由于LAMP具有很高的灵敏度,故应采取适当的措施防止污染,以防产生假阳性结果。大肠埃希菌是目前引起医院感染的首位致病菌,从我国医院对细菌耐药监测结果来看,大肠埃希菌的耐药检出率在逐年升高。特别是近十多年来,随着广谱β-内酰胺类抗生素,尤其是第三代头孢菌素的广泛使用,产AmpC酶的大肠埃希菌日益多见。AmpC酶的产生使大肠埃希菌对大量抗生素产生耐药性,通常包括青霉素和除头孢匹罗和头孢吡肟以外几乎全部的头孢菌素类药物。另外,产AmpC酶的大肠埃希菌也可能伴有ESBLs的产生,从而产生耐广谱头孢菌素的现象。同时产ESBLs和AmpC酶的大肠埃希菌通常还会携带其他的耐药基因,这将导致临床治疗更加困难,甚至导致严重的耐药性危机。建立适合临床应用的产AmpC酶细菌筛选体系和了解产AmpC酶细菌的流行情况是制定有效防治对策的前提。本研究旨在建立检测大肠埃希菌ampC基因的LAMP方法,验证将其运用于检测产AmpC酶大肠埃希菌的有效性,并初步探索检测ampC基因的应用价值。二、研究方法1.大肠埃希菌ampC基因LAMP检测方法的建立（1）根据GenBank公布的ampC基因序列（No:NC₀08490.1）,采用LAMP引物设计软件Primer Explorer4.0进行设计,得到一套特异性LAMP引物,包括两条外引物F3、B3,两条内引物FIP、BIP和两条环引物LB、LF。建立25μl的LAMP反应体系。（2）采用琼脂糖凝胶电泳的方法,对LAMP反应体系进行优化,确定反应体系中dNTPs、betaine（甜菜碱）、Mg2+的浓度,以及最佳的反应时间。（3）验证建立的LAMP方法的特异性和灵敏度,并与PCR法进行比较,探讨LAMP法的优势。2. LAMP法检测大肠埃希菌ampC基因的初步应用（1）用建立的LAMP方法检测54株大肠埃希菌临床分离株,并提取细菌质粒,计算质粒介导ampC基因所占的比例。（2）根据CLSI的标准,采用K-B纸片扩散法,进行头孢西丁纸片药敏试验对54株大肠埃希菌进行AmpC酶初筛。判断标准为头孢西丁（30μg/片）抑菌环直径≤18mm为AmpC酶初筛阳性。（3）采用反复冻融的方法,粗提54株大肠埃希菌的AmpC酶,进行三维试验筛选AmpC酶阳性菌株。（4）两两比较LAMP法、头孢西丁纸片法和三维试验法对大肠埃希菌AmpC酶的检测结果,评价LAMP在对耐药基因检测方面的临床应用价值。实验数据使用SPSS13.0软件包,进行x2检验和Kappa检验处理,P<0.05表示有显著差异,K>0.7表示吻合度较强。三、结果1、确定检测大肠埃希菌mpC基因的LAMP反应体系包括：2μlDNA模板,1.6μM内引物（FIP和BIP）,0.4μM外引物（F3和B3）,0.4μM环引物（LF和LB）,2.5μl10×Bst buffer,0.6mM dNTPs,1.0Mbetaine,12mMMgCl2,8U Bst DNA polymerase,补加ddH2O至25μ1。该体系在65℃下反应60min,经肉眼可观察到明显的白色沉淀,产物行2%琼脂糖凝胶电泳分析,可看到典型的梯形条带。2、LAMP的特异性与PCR一致,灵敏度比PCR高出10倍左右。3、采用LAMP和PCR两种方法,分别对54株大肠埃希菌临床分离株进行检查,两种方法的结果完全一致,均检出ampC基因阳性菌株41株,占75.93%,阴性13株,占24.07%；并检出由质粒携带ampC基因的菌株21株,占38.89%。4、头孢西丁药敏试验筛选出对头孢西丁敏感的大肠埃希菌32株,耐药22株。三维试验检测出AmpC酶阳性大肠埃希菌19株,阴性35株。其中耐药菌株和AmpC酶阳性菌株均为ampC基因阳性,而ampC基因阴性的菌株均对头孢西丁敏感且AmpC酶为阴性。5、统计学分析表明,LAMP与头孢西丁纸片药敏试验和三维试验之间的差异有统计学意义（P=0.000）,吻合度较弱（K值分别为0.358和0.294）；头孢西丁纸片药敏试验和三维试验之间的差异无统计学意义（P=0.25）,吻合度较强（K=0.882）。四、结论1、LAMP法可快速、准确地检测大肠埃希茵AmpC酶结构基因ampC,且该方法无需特殊的仪器设备,操作简单,适于在基层推广应用。2、LAMP法检测ampC基因为阴性的13株大肠埃希菌,头孢西丁纸片药敏试验和三维试验的检测结果均显示AmpC酶为阴性；对头孢西丁耐药的22株大肠埃希菌和三维试验阳性的19株大肠埃希菌,LAMP法检测结果均显示ampC基因为阳性;ampC基因检测为阳性而AmpC酶检测为阴性的大肠埃希茵,与抗生素作用后可能会诱导其表达AmpC酶并产生耐药性。以上表明LAMP对ampC基因的检测,有助于指导临床选择合适的抗菌药物,减少因错用、滥用抗生素而引起的细菌耐药。3、LAMP可检测质粒携带的ampC基因,有助于了解该耐药基因的传播速度和监测其流行趋势。