研究背景癌症可表现出生理和心理的多种症状,但是癌症引起的疼痛往往是关键症状之一。未经治疗的疼痛可严重影响患者的生活质量,并能影响癌症患者对治疗的耐受程度从而影响癌症患者的预后。随着癌症诊疗技术的进步,癌症患者生存时间明显延长,缓解癌症患者的疼痛,提高其生活质量成为突出问题。据估计癌症痛的患病率在新诊断出的癌症患者中为25%,在积极治疗的癌症患者中为33%,而在晚期癌症患者中癌症痛的患病率超过75%。由于现有临床治疗癌症痛措施的局限性,约45%的癌症患者的疼痛未得到有效控制。因而,对癌痛机制和镇痛手段的全面深入研究显得尤为重要。癌症导致的骨痛(简称骨癌痛)是癌症患者最常见的一种疼痛,也是肿瘤发生骨转移时最常见的症状之一。大约三分之一的晚期癌症患者会发生骨转移,而在乳腺癌和前列腺癌晚期患者中超过70%的患者发生骨转移,骨转移也是癌症痛最常见的原因。骨癌痛是癌症痛的典型代表,其主要表现是：持续的进行性的背景痛(Ongoing pain),爆发痛(Breakthrough pain)、痛觉过敏(Hyperalgesia)和痛觉超敏(Allodynia)。目前,临床上尚缺乏有效且副作用小的骨癌痛治疗措施,未合理控制的疼痛不但严重影响患者生活质量而且显著缩短生存期,这与对骨癌痛的发病机制缺乏了解有关。骨癌痛发生机制复杂,局部浸润的肿瘤细胞、炎症细胞及破/成骨细胞等产生的各种生物学活性物质,诱导外周和中枢神经系统的敏化,共同参与了骨癌痛的形成。并且,不同类型和不同阶段的肿瘤以及不同的肿瘤生长部位,均可影响骨癌痛的发生发展。近来研究表明,中枢神经下行易化系统激活对慢性疼痛的维持起重要作用。延髓头端腹内侧区(rostral ventromedial medulla, RVM)是下行痛觉调控系统的关键结构。RVM主要由中缝大核、网状巨细胞核α部和腹侧网状巨细胞核等神经核团组成,是整合脊髓上中枢痛觉调控信息并下行传递至脊髓的中继站。RVM内50%左右的神经元为5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)能神经元,其中含有5-HT生物合成的限速酶--色氨酸羟化酶(Tryptophan hydroxylase, TPH),其产生的5-HT可下行投射到脊髓背角,是下行调控系统参与脊髓疼痛处理的主要神经递质,来自RVM区的下行5-HT对脊髓的痛觉信息处理起重要作用。同时,在神经病理性痛等慢性疼痛当中,RVM区胶质细胞活化并参与慢性疼痛的形成。但是,在骨癌痛中来自RVM区并下行投射到脊髓背角的5-HT对脊髓痛觉信息处理的具体作用以及骨癌痛中RVM区胶质细胞是否参与下行痛觉调控均尚不清楚。以RVM为治疗靶点研究癌痛治疗策略可不受肿瘤生长、转移部位的限制,还可有效控制癌症治疗引起的多发性神经病理性痛。基于此,本研究拟通过探讨从RVM区投射到脊髓的5-HT能下行通路以及RVM区胶质细胞在骨癌痛大鼠疼痛机制中的作用,以期寻找癌痛治疗的新靶点和新的治疗策略。研究方法与结果1.骨癌痛大鼠脊髓背角5-羟色胺含量的变化及意义方法：实验一(骨癌痛大鼠脊髓背角5-HT含量与其痛阈的相关性分析)：雌性SD大鼠57只,随机分为3组,每组19只。1)正常对照组(Naive):不作任何处理;2)假手术组(Sham):于右侧胫骨上段骨髓腔注射D-hank’s液10μl；3)骨癌痛组(CIBP):于右侧胫骨上段骨髓腔接种10μl(约3×104)Walker256大鼠乳腺癌细胞悬液制备胫骨癌痛模型。实验二(鞘内注射5-羟色胺能选择性神经毒素5,7-DHT对骨癌痛大鼠痛阈的影响)：雌性SD大鼠56只,随机分为4组,每组14只。1)Sham-Saline组：假手术后第10天鞘内置管,第14天鞘内给生理盐水(20μl)；2)Sham-5,7-DHT组：假手术后第10天鞘内置管,第14天鞘内给5,7-DHT (60μg); 3) CIBP-Saline组：造模后第10天鞘内置管,第14天鞘内给生理盐水(20μl)；4)CIBP-5,7-DHT组：造模后第10天鞘内置管,第14天鞘内给5,7-DHT(60μg)采用痛觉行为学和组织病理学方法鉴定模型构建成功。分别于术后第7、14和21天取各组大鼠脊髓背角组织,采用高效液相色谱法检测脊髓背角组织中5-HT含量,并与相应时点的机械缩爪阈值和缩爪持续时间做双变量相关分析。检测鞘内给予5,7-DHT对大鼠痛觉行为学的影响。采用高效液相色谱分析和免疫荧光染色检测5,7-DHT对脊髓背角5-羟色胺能神经的毁损效应。结果：肿瘤细胞接种后7～21 d大鼠机械缩爪阈值明显降低,缩爪持续时间延长,移动诱发痛评分进行性升高(P<0.05)。光镜下肿瘤注射部位可见大量肿瘤细胞浸润,骨组织结构严重破坏,表明模型制备成功。与对照组相比,骨癌痛组大鼠接种后7～21d时机械痛阈降低,接种后7、14和21d时脊髓背角5-HT含量升高,且5-HT含量与机械痛阈呈显著相关(P<0.05)。鞘内注射5,7-DHT后可显著降低脊髓背角中5-HT含量,并能显著缓解骨癌痛大鼠的疼痛行为。2.靶向抑制RVM区5-羟色胺能下行易化作用在骨癌痛大鼠的镇痛效应评价方法：雌性SD大鼠108只,随机分为4组,每组27只。1)Sham-Saline组：假手术后第14天RVM区给生理盐水(0.5μl)；2)Sham-PCPA组：假手术后第14天RVM区给PCPA(50μg)；3)CIBP-Saline组：造模后第14天RVM区给生理盐水(0.5μl);4)CIBP-PCPA组：造模后第14天RVM区给PCPA(50μg).检测各组大鼠不同时点的机械缩爪阈值、缩爪持续时间和移动诱发痛评分。免疫印迹法检测RVM区TPH的表达。高效液相色谱法检测RVM给药后不同时点脊髓背角5-HT含量。应用免疫荧光染色法检测RVM区和脊髓背角5-HT的表达。结果：色氨酸羟化酶选择性抑制剂PCPA可下调RVM区5-HT的表达,并可降低大鼠脊髓背角的5-HT含量(P<0.05)。行为学检测发现,RVM区注射PCPA后大鼠触诱发痛阈值升高,缩爪持续时间缩短且移动诱发痛评分减低(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示RVM区注射PCPA可降低脊髓背角5-HT含量。3.RVM区5-羟色胺能下行易化作用参与大鼠骨癌痛的机制研究方法：实验一：雌性SD大鼠48只,随机分为4组,每组12只。1)Sham-DMSO组：假手术后第14天RVM区注射DMSO(1μl)；2)Sham-SB203580:假手术后第14天RVM区注射SB203580(50μg)；3)CIBP-DMSO组：造模后第14天RVM区注射DMSO (1μl); 4) CIBP-SB203580组：造模后第14天RVM区注射SB203580(50μg)。检测各组大鼠不同时点的痛阈。免疫印迹法检测RVM区给药后TPH的表达。高效液相色谱法分析RVM区给药后脊髓背角5-HT含量。应用免疫荧光染色法分别检测RVM区TPH和脊髓背角5-HT的表达。实验二：雌性SD大鼠12只,随机分为2组：正常对照组(Naive组,n=3)和骨癌痛组(CIBP组,n=9)。分别于模型构建后第7、14和21d处死大鼠,取脊髓腰膨大组织进行基因芯片检测5-HT受体的表达。结果：骨癌痛大鼠RVM区注射p38MAPK选择性抑制剂SB203580后机械缩爪阈值显著升高,缩爪持续时间明显缩短且移动诱发痛评分显著降低(P<0.05)。免疫蛋白印迹检测发现,RVM区注射SB203580在产生镇痛作用的同时显著抑制了RVM区色氨酸羟化酶(TPH)的蛋白表达(P<0.05)。免疫荧光染色显示RVM区注射SB203580后RVM区TPH染色阳性神经元减少。高效液相色谱分析结果显示脊髓背角5-HT的水平降低(P<0.05)。基因芯片结果显示,骨癌痛大鼠脊髓中参与5-HT易化疼痛作用和抑制疼痛作用的受体表达均上调,但参与易化作用的受体表达高于抑制作用的受体。4.RVM区胶质细胞活化参与大鼠骨癌痛的机制研究方法：雌性SD大鼠99只,随机分为7组：1)正常对照组(Naive,n=6):不做任何处理；2)假手术组(Sham,n=18):于右后肢胫骨上段骨髓腔注射D-hank’s液10μl；3)骨癌痛组(CIBP,n=18):于右后肢胫骨上段骨髓腔注射walker256乳腺癌细胞悬液10μl(3×104个)；4)假手术加生理盐水组(sham/NS,n=15):假手术后第10天RVM注射生理盐水0.5μl；5)骨癌痛加生理盐水组(CIBP/NS,n=15):骨癌痛造模后第10天RVM注射生理盐水0.5μl；6)骨癌痛加米诺环素组(CIBP/Minocycline,n=15):骨癌痛造模后第10天RVM注射小胶质细胞抑制剂米诺环素0.5μl(25μg)；7)骨癌痛加氟代柠檬酸组(CIBP/Fluorocitrate,n=12):骨癌痛模型构建后第10天RVM注射星形胶质细胞抑制剂氟代柠檬酸1μg。应用影像学方法检测骨癌痛大鼠胫骨骨质的破坏情况。荧光定量PCR法检测RVM区胶质细胞活化标志物mRNA表达的变化。Western-blot和免疫荧光染色检测不同药物处理对RVM胶质细胞活化的影响。痛觉行为学检测不同药物处理后大鼠痛阈的改变。荧光定量PCR法检测RVM给予小胶质细胞抑制剂后促炎性介质IL-1β、IL-6、TNF-α和脑源性神经营养因子(BDNF)的表达。结果：骨癌痛大鼠RVM区小胶质细胞和星形胶质细胞显著活化,且小胶质细胞释放的促炎性介质IL-1β、IL-6、TNF-α和BDNF表达升高(P<0.05)。RVM区注射小胶质细胞抑制剂和星形胶质细胞抑制剂可分别抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,并能呈时间依赖性的缓解骨癌痛大鼠的疼痛。RVM区注射小胶质细胞抑制剂可逆转小胶质细胞释放的促炎性介质的高表达,并能有效地缓解骨癌痛大鼠的疼痛。5统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示；两组数据之间比较采用t检验,多组数据之间比较采用方差分析(ANOVA),分析后post-hoc检验采用Student-Newman-Keuls test,脊髓背角5-HT含量与机械痛阈进行双变量相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究总结一、主要研究结果1.骨癌痛大鼠脊髓背角5-HT含量增加,且与大鼠疼痛程度呈正相关关系。鞘内注射5,7-DHT选择性消除脊髓5-HT可显著缓解骨癌痛大鼠的疼痛。脊髓背角5-HT参与了大鼠骨癌痛的维持。2.骨癌痛大鼠RVM区向脊髓背角的5-HT投射增多,并参与了骨癌痛的下行易化作用。3.骨癌痛大鼠RVM区TPH的表达增高,5-HT合成和向脊髓投射增加并起下行易化作用,这一过程与骨癌痛中RVM区p38MAPK通路激活有关。骨癌痛大鼠脊髓背角中与5-HT下行痛觉易化作用和抑制作用有关的受体表达均增高,但是参与易化作用的受体表达水平高于抑制性受体,5-HT受体的抑制和易化疼痛的平衡向易化疼痛的方向偏移。4.骨癌痛大鼠RVM区小胶质细胞和星形胶质细胞活化,胶质细胞释放的促炎性介质表达上调。RVM区注射小胶质细胞抑制剂和星形胶质细胞抑制剂可分别抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化,并能呈时间依赖性的缓解骨癌痛大鼠的疼痛。RVM区注射小胶质细胞抑制剂米诺环素可逆转胶质细胞释放的促炎性介质的高表达,并能有效地缓解骨癌痛大鼠的痛觉超敏。二、研究结论].RVM区5-羟色胺能下行易化作用参与了大鼠骨癌痛的维持,其机制包括：(1)骨癌痛中RVM区p38MAPK通路激活并促进了该区内色氨酸羟化酶(TPH)的表达增高,促使RVM区5-羟色胺能神经元合成并向脊髓投射的5-HT增加。(2)脊髓中5-HT受体的抑制和易化疼痛的平衡向易化疼痛的方向偏移。2.RVM区胶质细胞活化参与了大鼠骨癌痛的维持,其机制与胶质细胞活化并释放下游促炎性介质增强下行痛觉易化作用有关。三、创新之处1.本研究首次证实RVM区5-羟色胺能下行通路参与了大鼠骨癌痛的下行痛觉易化作用,其机制与5-HT下行投射增多和脊髓5-HT受体向易化疼痛的方向偏移有关。2.本研究首次证实RVM区胶质细胞活化参与了大鼠骨癌痛的维持,其机制与胶质细胞激活并释放下游促炎性介质增强下行痛觉易化作用有关。四、展望1.本研究中骨癌痛大鼠脊髓5-HT受体表达发生不同程度的改变,使得脊髓5-HT呈现易化疼痛的作用,但由于5-HT受体家族成员众多,每种受体在不同疼痛状态中的定位和功能仍需深入研究,以获得新的疼痛治疗靶点。2.本研究中RVM区胶质细胞活化参与了大鼠骨癌痛的下行易化,5-HT及其受体与胶质细胞之间存在联系,深入研究不同疼痛状态中二者之间的关系,有望为疼痛治疗提供新途径。